為實(shí)現(xiàn)梔子油中重要活性物質(zhì)藏紅花酸的準(zhǔn)確定量，選取超聲輔助液液萃取和固相萃取2種前處理方法進(jìn)行系統(tǒng)探討，重點(diǎn)考察了溶油試劑、料液比、萃取試劑種類、萃取試劑濃度、液液萃取時(shí)間、液液萃取溫度以及液液萃取次數(shù)等因素。

在2種前處理方法的最優(yōu)條件下，超聲輔助液液萃取獲得的藏紅花酸含量高于固相萃取，且超聲輔助液液萃取操作簡單、耗時(shí)短、能耗低。因此，最優(yōu)前處理?xiàng)l件確定為：超聲輔助液液萃取，以N，N-二甲基甲酰胺（DMF）為溶油試劑，料液比為0.5 g油：5 mL DMF，100%甲醇為萃取試劑，室溫超聲2 min，萃取1次，檢測(cè)到的梔子油中藏紅花酸含量的平均值為69.65 μg/g（RSD=4.45%）。

在此基礎(chǔ)上，對(duì)菜籽油進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平均加標(biāo)回收率為86.61%（RSD=1.16%），體現(xiàn)了方法的可行性和穩(wěn)定性。該實(shí)驗(yàn)建立的方法可用于梔子油中藏紅花酸的HPLC快速、準(zhǔn)確定量檢測(cè)。

藏紅花酸化學(xué)式為C20H24O4，屬于類胡蘿卜素。藏紅花酸是珍貴的藥用資源，在預(yù)防心血管疾病方面具有一定功效，通過增強(qiáng)脂質(zhì)和膽固醇的排泄，防治高血脂和動(dòng)脈粥樣硬化。此外，藏紅花酸還具有預(yù)防阿爾茨海默病、減少皮膚損傷、抗抑郁、保護(hù)肝臟、抗腫瘤等作用。

目前，大多將藏紅花作為獲取藏紅花酸的來源，而藏紅花價(jià)格昂貴，是意大利、土耳其、伊朗等地栽培的一種草本植物。梔子具有多種生物活性，是除藏紅花以外，唯一含有藏紅花酸的植物。藏紅花在我國少有種植，而梔子相對(duì)便宜、適應(yīng)性強(qiáng)、種植成活率高，是原產(chǎn)于我國的重要木本植物資源之一。

藏紅花酸含量是梔子質(zhì)量的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。目前，關(guān)于梔子中藏紅花酸含量的檢測(cè)方法已有一些報(bào)道，如：張永利等采用酶解法將梔子果中的藏紅花素轉(zhuǎn)化為藏紅花酸，并用紫外分光光度法進(jìn)行檢測(cè)。陳雁等采用HPLC法檢測(cè)梔子果中的藏紅花酸和藏紅花素。梔子果具有20%～25%的可食用脂肪，可加工成梔子油，類似山茶油和橄欖油等產(chǎn)品，屬于國家支持、倡導(dǎo)的大健康新型木本植物油。

CAI X等通過HPLC-DAD/ESI-MS發(fā)現(xiàn)梔子油中含有藏紅花酸。食用油中的微量活性營養(yǎng)物質(zhì)是評(píng)價(jià)食用油品質(zhì)的重要指標(biāo)。而藏紅花酸作為一種梔子油特有的功能性成分，也許可以作為評(píng)價(jià)梔子油營養(yǎng)品質(zhì)的重要參考指標(biāo)。GB 509.149—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中梔子黃的測(cè)定》中涉及到液體中藏紅花酸的分析方法，將醬油等液體用甲醇溶解后直接進(jìn)樣檢測(cè)，但該法并不適用于植物油。

由于植物油不能溶解在甲醇中，所以油料需先經(jīng)過溶油試劑處理，再用有機(jī)溶劑萃取其中的藏紅花酸。因此，如何有效溶油并高效提取、檢測(cè)其中的藏紅花酸是方法的重點(diǎn)所在，現(xiàn)階段，植物油中藏紅花酸的定量檢測(cè)方法未見報(bào)道。

超聲輔助液液萃取法是一種傳統(tǒng)的樣品分離技術(shù)。該方法無需多余儀器，耗時(shí)短、效率高，但對(duì)于樣品的分離純化可能不夠完全。如：劉金銘等采用超聲輔助液液萃取提取食品中的活性成分。

固相萃取法對(duì)于樣品的凈化效果更好，可以降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度，但固相萃取SPE小柱價(jià)格較高。如：陳坤等采用C18固相萃取柱對(duì)食用油凈化，檢測(cè)其中的乙基麥芽酚。

文章系統(tǒng)比較了2種前處理技術(shù)，篩選得到了梔子油中藏紅花酸的最優(yōu)提取方法，建立了梔子油中藏紅花酸的HPLC快速、準(zhǔn)確定量檢測(cè)方法，為梔子中藏紅花酸的研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)梔子健康功能油的開發(fā)及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了重要工具。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

藏紅花酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）；Methyl Alcohol（HPLC級(jí)）、Acetonitrile（HPLC級(jí)）；乙醇、甲醇、異丙醇、乙腈、乙酸、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、石油醚、氯仿；正己烷、吡啶；CNWBOND Diol二醇基固相萃取SPE小柱；梔子油：浙江驕梔科技有限公司；原香菜籽油：金太陽糧油股份有限公司。

BAS224S分析天平，DS-2510DTH超聲波清洗器，D-37520超速離心機(jī)，SHB-Ⅲ-A循環(huán)水式多用真空泵，Essentia LC-16島津高效液相色譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液的制備

藏紅花酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備：準(zhǔn)確稱取0.60 mg（精確至0.1 mg）藏紅花酸標(biāo)準(zhǔn)品，用吡啶溶解完全后，加入甲醇（色譜級(jí)）并轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，混勻，定容，獲得12 μg/mL的藏紅花酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.2 HPLC色譜條件

色譜柱為反相柱子Kinetex 5u XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Phenomenex）。色譜條件參照GB 509.149—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中梔子黃的測(cè)定》：流動(dòng)相為乙酸-乙酸銨緩沖溶液（A）-乙腈（B）；洗脫梯度：0.0～1.0 min，20%B；1.10～8.0 min，20%～60%B；8.0～8.1 min，60%～70%B；8.10～13.0 min，70%～98%B；13.10～15.0 min，98%～20%B；15.10～20.0 min，20% B；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為35 ℃。

1.2.3 超聲輔助液液萃取

1.2.3.1 溶油試劑種類及料液比

稱取0.5 g梔子油于燒杯中，分別加入5 mL正己烷、DMF、石油醚、氯仿溶油。待油液全部溶解后，加入10 mL 100%的甲醇，常溫條件，立即超聲2 min。超聲后，經(jīng)8000 r/min離心10 min，分層后吸取有機(jī)相，用甲醇定容到25 mL容量瓶中。分別取2 mL樣液，經(jīng)0.45 μm尼龍66濾膜過濾后，進(jìn)行液相分析。選擇好溶油試劑之后，再對(duì)料液比進(jìn)行優(yōu)化：即分別加入2.5、5、7.5、10、12.5 mL DMF。

1.2.3.2 萃取試劑種類及濃度

稱取0.5 g梔子油于燒杯中，加入5 mL DMF，待油液全部溶解后，分別加入10 mL濃度100%的乙酸、乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇，立即超聲2 min，超聲后經(jīng)8000 r/min離心10 min，分層后吸取有機(jī)相，甲醇定容到25 mL的容量瓶中。分別取2 mL樣液，經(jīng)0.45 μm尼龍66濾膜過濾后，進(jìn)行液相分析。選擇好萃取試劑之后，再對(duì)萃取試劑濃度進(jìn)行優(yōu)化：即分別加入濃度70%、80%、90%、100%的甲醇。

1.2.3.3 溫度及時(shí)間對(duì)提取梔子油中藏紅花酸的影響

稱取0.5 g梔子油于燒杯中，加入5 mL DMF，待油液全部溶解后，加入10 mL濃度100%的甲醇，保持時(shí)間2 min不變，分別在30、60、90 ℃條件下進(jìn)行前處理，然后經(jīng)8000 r/min離心10 min，分層后吸取有機(jī)相，甲醇定容到25 mL的容量瓶中。分別取2 mL樣液，經(jīng)0.45 μm尼龍66濾膜過濾后，進(jìn)行液相分析。時(shí)間條件為：30 ℃時(shí)，分別在2、12、22、32 min條件下進(jìn)行前處理。

1.2.3.4 萃取次數(shù)

確定溶油試劑、料液比、萃取試劑種類及濃度、超聲溫度和時(shí)間等因素后，對(duì)萃取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化：稱取0.5 g梔子油于燒杯中，加入5 mL DMF，待油樣全部溶解后，加入10 mL 100%的甲醇，立即超聲2 min，超聲后經(jīng)8000 r/min離心10 min，分層后吸取有機(jī)相，甲醇定容到50 mL的容量瓶中，獲得萃取1次的樣品；稱取0.5 g梔子油于燒杯中，加入5 mL DMF，待油樣全部溶解后，加入10 mL 100%的甲醇，立即超聲2 min，超聲后經(jīng)8000 r/min離心10 min，分層后吸取有機(jī)相到50 mL容量瓶中。

再次往離心后的油相中加入5 mL DMF，待油樣全部溶解后，加入10 mL 100%的甲醇，立即超聲2 min，超聲后經(jīng)8000 r/min離心10 min，分層后吸取第二次的有機(jī)相到放置于第一次有機(jī)相的50 mL的容量瓶中，并用甲醇定容。此為提取2次的樣品。同理可得，提取3次的樣品。分別取2 mL樣液，經(jīng)0.45 μm尼龍66濾膜過濾后，進(jìn)行液相分析。

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