6、注意事項

(1)本法測定的結(jié)果為粗蛋白質(zhì)的含量。如要測定純蛋白質(zhì)的含量，則樣品應(yīng)先用蛋白質(zhì)沉淀劑如堿性硫酸銅、堿性乙酸鉛、單寧酸溶液［p(C₇₆H₅₂0₄₆)=200g·L^-1]、三氯乙酸溶液［p(C₂HC1₃0₂)=100g·L^-1〕等處理，將蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀出來，再測定此沉淀的全氮量，乘以蛋白質(zhì)的換算系數(shù)即可得“純蛋白質(zhì)”量。其具體步驟是:稱取風(fēng)干磨細(xì)樣品0.5× × ×g～2.2×××g，放于150 mL燒杯中，加59 mL沸水，加熱至沸，5min后取下，放置30 min(如含淀粉多的樣品，則勿加熱至沸，而是加入50 mL沸水，再放入401～50℃水浴中保溫10 min即可，然后趁熱加入CuSO₄及NaOH溶液)。然后緩緩注入硫酸銅溶液〔p(CuSO₄)=60g·L^-1]25 mL，用玻棒攪拌，同時加入氫氧化鈉溶液[p(NaOH)=12.5g·L^-1]25mL，放置0.5h～1 h使沉淀完全(也可放置過夜)，用傾瀉法過濾，然后用沸水洗沉淀，至濾液遇BaCl₂溶液不產(chǎn)生白色BaSO₄沉淀為止，間接指示非蛋白質(zhì)含氮物已經(jīng)洗凈。將已洗凈的沉淀及濾器一起放入60 ^oC烘箱中烘至稍干即可。將已烘干的沉淀連帶濾紙，無損地轉(zhuǎn)入開氏瓶中。

樣品的消煮：稱取烘干樣品(過0.25mm篩子)0.3g～0.5g置于50mL或100mL開氏瓶或消煮管中，加入混合催化劑1.8g，加幾滴水濕潤后，加5 mL濃H₂S0₄，小心輕搖后(最好加塞放置過夜)，蓋上小漏斗，將消煮管放置在消煮爐或電爐上，開始時用小火加熱，當(dāng)消煮液呈棕色時，提高溫度，消煮至溶液呈清亮帶淺藍(lán)色時，再加熱約10min，取下，冷卻至溫?zé)釙r，將消煮液無損地轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，冷卻至室溫后，定容并放置澄清。

氮的測定：用移液管吸取澄清待測液5.00 mL或10.00 mL放入半微量定氮儀中進(jìn)行定氮(以下操作同土壤全氮的測定)。同時作空白試驗，校正試劑和滴定誤差，并做核對試驗。

（2）稱樣量的大小取決于樣品的含氮量。若含氮為1%～5%，稱樣量為0.30g，可根據(jù)含氮量的水平適當(dāng)增減稱樣量。

（3）在消煮過程中須經(jīng)常轉(zhuǎn)動開氏瓶，使噴淺在瓶壁上的樣品及早回流至硫酸溶液中。特別是開始消煮后不久，會有大量氣泡上逸，升溫不宜過快，以防溢出。

（4）核對試驗是將已知量的NH₄⁺-N標(biāo)準(zhǔn)溶液〔如p（N)=100mg·L^-1NH₄⁺-N標(biāo)準(zhǔn)溶液10mL，其中含N lmg］放入半微量定氮蒸餾裝置中，按測定樣品同樣操作步驟進(jìn)行蒸餾、滴定，用以檢驗蒸餾過程中的誤差大小。

（三）同類種子中蛋白質(zhì)的測定〔染料結(jié)合(DBC法)]

1、方法原理

蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(賴氨酸、精氛酸和組氨酸)的一NH₂、咪唑基和胍基，以及蛋白質(zhì)末端自由氨基在pH2～pH3的酸性緩沖液體系中呈陽離子狀態(tài)存在，可以和偶氮磺酸染料類物質(zhì)如桔黃G，酸性橙12^#等的陰離子結(jié)合，形成不溶于水的蛋白質(zhì)-染料絡(luò)合物而沉淀下來，通過測定一定量樣品與一定量體積的已知濃度染料溶液反應(yīng)前后溶液中染料濃度的變化，可計算出樣品的染料結(jié)合量，即每克樣品所結(jié)合的染料的毫克數(shù)。染料結(jié)合量的大小反映出樣品中堿性氨基酸的多少。在小麥、大麥、水稻、大豆、花生等種子中，蛋白質(zhì)的含量與堿性氨基酸的含量之間有很好的相關(guān)性。因此，可以用染料結(jié)合量來評比同種作物種子大量原始材料之間蛋白質(zhì)含量的高低。

如果要從染料結(jié)合量來計算樣品的粗蛋白質(zhì)的含量，則需要用開氏法測定同類種子的一批樣品的粗蛋白質(zhì)，同時也用染料結(jié)合法測定其染料結(jié)合量，然后求出粗蛋白質(zhì)對染料結(jié)合蛋的回歸方程或繪出回歸曲線。這樣，測定未知樣品的染料結(jié)合量，就可以從回歸方程計算或查回歸線得到粗蛋白質(zhì)了。若只需比較蛋白質(zhì)含量的高低(如在篩選同種作物種子的大批樣品時)，則不必知道蛋白質(zhì)的絕對含量，而只要測定樣品的染料結(jié)合是即可進(jìn)行比較。

該法是間接測定種子中蛋白質(zhì)的方法，方法簡單、快速，與開氏法的相關(guān)性較好但準(zhǔn)確性較差，適用于大批樣品的篩選工作。美國谷物化學(xué)協(xié)會將該法列為分析小麥蛋白質(zhì)含量的正式方法(AACC 11-2-72)?，F(xiàn)已有據(jù)此方法原理而設(shè)計的蛋白質(zhì)分析儀。但該法對隨意混合物的樣品不適用。

2、主要儀器

水平振蕩器;離心機(jī);GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀或721型分光光度計。

3、試劑

染料溶液:稱取檸檬酸(C₆H₈0₇. H₂O，分析純)20.70g和磷酸氫二鈉Na₂HP0₄. 12H₂0,分析純))1.44g溶于300mL～400mL水，全部轉(zhuǎn)入1000 mL容量瓶中。另外準(zhǔn)確稱取1.000g桔黃G (C₁₆H₁₀O₇S₂Na₂，分子量452.38)，加少量水在80^oC水浴上溶解。無損地轉(zhuǎn)入上述容量瓶中，再加入百里酚乙醇溶液〔p(C₁₀H₁₄)=100g·L^-1]3滴～5滴以防腐，定容。此溶液為1000 mg·L^-1染料溶液。

4、操作步驟

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品測定的同時，取1000mg·L^-1的染料溶液10mL、30mL、50mL、60mL、70mL、80mL放入100 mL容量瓶中，用水定容，即得濃度系列為100mg·L^-1、300mg·L^-1、500mg·L^-1、600mg·L^-1、700mg·L^-1、800mg·L^-1的染料標(biāo)準(zhǔn)溶液，可用GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀測透光率(T)，并用半對數(shù)座標(biāo)紙繪制濃度一透光率(T)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以把染料溶液用水稀釋50倍后，用0.5cm比色槽和482nm的波長測定吸收值(A)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品的測定稱取通過0.25mm篩子的谷物樣品0.2 g～0.7g(精確至0.001g),放入30mL試管中，加入1000g·L^-1染料溶液20 mL蓋緊試管口，在水平振蕩器上振蕩60min，使樣品和染料溶液充分反應(yīng)，取反應(yīng)后的渾濁液((8mL～10 mL即可)注入離心管中，以3000 r·min^-1的速度離心8min～12 min,至上部溶液沒清為止，以下操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）回歸方程選取粗蛋白質(zhì)含量從低到高(如小麥種子粗蛋白質(zhì)含量可從7%～17%)的同一類谷物樣品35個左右，用開氏法測其粗蛋白質(zhì)，并用上述方法測定各樣品的染料結(jié)合量。根據(jù)所得的結(jié)果，計算出染料結(jié)合量與蛋白質(zhì)之間的回歸方程。從測得的未知樣品的染料結(jié)合量,求出蛋白質(zhì)的含量。

5、結(jié)果計算

樣品的染料結(jié)合量計算公式如下:

式中:B——每克樣品所結(jié)合的染料的毫克數(shù)mg·g^-1。

V——加入染料溶液的總體積mL;

10^-3——將mL換算成L的系數(shù);

Co——染料溶液的初始濃度，mg·g^-1；

C——染料結(jié)合反應(yīng)后殘余溶液中的染料濃度,mg ·g^-1;

m——樣品的質(zhì)量，g。

6、注意事項

（1）在偶氮磺酸染料中，除桔黃G外，也可以使用酸性12^#(Acid Orange 12^#，縮寫AO₁₂,C₁₆H₁₁O₄N₂SNa，分子量 305.37)，它的分子結(jié)構(gòu)與桔黃G基本相同，也含有一個偶氮發(fā)色基團(tuán)，但只有一個磺酸基，即一個結(jié)合堿基的位置(桔黃G二個)，后者每個堿基結(jié)合點引起的顏色變化約是枯黃G的兩倍。故其更適合于在染料結(jié)合法中應(yīng)用，它們在482 nm左右有一個較寬的吸收峰，便于比色測定。

（2）樣品稱樣量按蛋白質(zhì)含量的高低而定，水稻、小麥、大麥等樣品可稱取0.5g，玉米稱取0.7g，大豆稱取0.2g，花生及魚粉等可少一些。

（3）染料結(jié)合反應(yīng)的條件，如染料的pH、樣品的粒度、振蕩反應(yīng)的時間和溫度等都會影響測定的結(jié)果，故每次測定應(yīng)力求反應(yīng)條件一致，特別是在測定樣品與測定回歸方程的樣品時，反應(yīng)條件尤需一致。

參考資料：土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法