吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone，PQQ)是一種不同于煙酰胺核苷酸(NAD⁺和NADP⁺)和黃素核苷酸(FAD和FMN)的新有機(jī)輔酶，上世紀(jì)60年代在研究非磷酸化細(xì)菌的葡萄糖代謝過(guò)程中被首次發(fā)現(xiàn)。從微生物到人體組織，PQQ在自然界的分布范圍極廣。動(dòng)物和人類通過(guò)飲食途徑獲取PQQ以滿足機(jī)體需要。PQQ具有極其獨(dú)特的理化性質(zhì)，其促生長(zhǎng)、抗應(yīng)激和在動(dòng)植物發(fā)育繁殖方面的營(yíng)養(yǎng)作用越來(lái)越受到重視。目前對(duì)于PQQ主成分的含量測(cè)定方法較多，但測(cè)定PQQ中雜質(zhì)的方法鮮有報(bào)道，本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究建立了HPLC法測(cè)定PQQ中咪唑并吡咯喹啉(IPQ)雜質(zhì)含量的方法。

一、材料與方法

1、儀器與材料

Agilent1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；METTLER-TOLEDOXS205DU型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；乙腈(上海星可高純?cè)噭┯邢薰?；磷酸氫二鉀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；四丁基溴化銨(阿拉丁)；磷酸(ScharlabS.L)；PQQ及IPQ對(duì)照品為自制；PQQ樣品為自制(批號(hào)為17901、17902、17903)。

2、色譜條件

TCIKaseisorbLCODS2000色譜柱(4.6mm×150mm，5lxm)；流動(dòng)相為乙腈-緩沖溶液(配制10mmol的磷酸氫二鉀和15mmol的四丁基溴化銨水溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.4)[28:72]；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為259nm；流速為1.0mL／min；進(jìn)樣量為20μL。

3、溶液配制

對(duì)照品溶液：精密稱取PQQ對(duì)照品適量，用稀釋劑(乙腈-水=[1:3])定量稀釋制成每lmL中約PQQ 0.1μg的溶液。供試品溶液：精密稱取PQQ樣品適量，用稀釋劑定量稀釋制成每lmL中約PQQ 0.1mg的溶液。

4、檢測(cè)方法

取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積按外標(biāo)法計(jì)算供試品中IPQ的含量。

二、結(jié)果與討論

1、專屬性試驗(yàn)

取空白溶液、對(duì)照品溶液和混合溶液進(jìn)樣并記錄色譜圖，并用tPQ對(duì)照品溶液進(jìn)行定位；確定出峰順序與分離度，PQQ于IPQ之間的分離度為3.1，大于1.5，空白溶液無(wú)干擾。空白溶液圖譜見(jiàn)圖1，對(duì)照品溶液圖譜見(jiàn)圖2，混合溶液圖譜見(jiàn)圖3。

2、檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)

精密稱取IPQ對(duì)照品適量，用稀釋劑溶解并逐級(jí)定量稀釋，測(cè)試IPQ峰的信噪比，確定檢測(cè)限和定量限，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，檢測(cè)限圖譜見(jiàn)圖4，定量限圖譜見(jiàn)圖5。擬定PQQ中IPQ的限度為不大于0.1％，本文綜合檢測(cè)限與定量限的結(jié)果選擇0.05％為報(bào)告水平。
 

3、精密度試驗(yàn)

0.10％和0.15％水平加入IPQ，每個(gè)濃度依法平取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果對(duì)照品溶液種主峰面積的RSD為1.4％，表明儀器精密度良好。取同一批樣品，依法平行操作制備6份供試品溶液，分別測(cè)定，結(jié)果均未檢出IeQ。取同一批樣品，分別在0.05％、0.10％和0.15％水平加入IPQ，每個(gè)濃度依法平行操作制備3份加標(biāo)溶液，分別測(cè)定，結(jié)果9份加樣回收率的RSD為3.2％，表明方法重復(fù)性良好。不同分析員使用不同的儀器對(duì)同一批樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果一致，表明方法中間精密度良好。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和線性關(guān)系的考察

配制IPQ濃度分別為0.05、0.08、0.1、0.15、0.2μg／mL的溶液，分別進(jìn)樣并記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)，得到線性方程為Y=77.7168X+0.042976，線性相關(guān)系數(shù)為0.99976，結(jié)果表明IPQ在線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

5、加樣回收率試驗(yàn)

分別在供試品中加入規(guī)定濃度的0.05％、0.10％和0.15％水平的IPQ，依法處理并測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度。

6、溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別室溫放置12h、24h、36h后進(jìn)樣檢測(cè)，放置后與0h檢測(cè)結(jié)果相比，對(duì)照品溶液PQQ峰面積變化均不大于4.0％，供試品溶液測(cè)定結(jié)果一致，表明溶液在36h內(nèi)穩(wěn)定。

7、耐用性試驗(yàn)

分別改變測(cè)試條件，如改變流動(dòng)相中有機(jī)相的比例、流動(dòng)相中緩沖溶液的pH、柱溫及流速，依法測(cè)定，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定結(jié)果一致，表明本方法具有良好的耐用性。

8、樣品含量測(cè)定

取PQQ樣品，依法測(cè)定，結(jié)果均未檢出IPQ，表明產(chǎn)品均符合擬定質(zhì)量指標(biāo)要求，具體見(jiàn)表3。

在方法建立過(guò)程中，考慮到IPQ雜質(zhì)相對(duì)于PQQ產(chǎn)品的制備成本會(huì)高很多，對(duì)IPQ相對(duì)于PQQ的相對(duì)響應(yīng)因子(RRF)進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果為1.089，介于0.9～1.1之間，因此采用PQQ作為外標(biāo)法計(jì)算的對(duì)照品，大大減少了IPQ雜質(zhì)對(duì)照品的用量。

三、結(jié)論

方法學(xué)驗(yàn)證表明，建立的HPLC法測(cè)定PQQ中IPQ含量的方法，具有良好的專屬性、檢測(cè)靈敏度、精密度、線性和準(zhǔn)確度，方法較為簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，能夠比較好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，易于推廣應(yīng)用，適用于PQQ中IPQ的質(zhì)量控制。

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