（2）綠豆多肽抗氧化性與酶濃度的關(guān)系

參照于慧等人的方法進(jìn)行DPPH自由基清除率的測定。將2mL一定濃度的綠豆多肽溶液和2mL的0.12mm01·L^-1DPPH溶液進(jìn)行混合，避光于25℃條件下反應(yīng)30min，取出后于517nm波長下進(jìn)行吸光值的測定，此時吸光度值記錄為A_i；將上述過程中的2mLDPPH溶液用無水乙醇取代，然后與2mL綠豆多肽溶液進(jìn)行反應(yīng)，此條件下測定吸光值記錄為A_j，將2mL無水乙醇與2mLDPPH溶液反應(yīng)的條件作為空白組，此時記錄吸光值為Ao。結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)酶濃度低于6％時，DPPH清除率隨著酶濃度的增加而增大，當(dāng)酶濃度超過6％時，DPPH清除率隨著酶濃度的升高而降低。整體呈現(xiàn)先上升后下降的原因在于隨著酶濃度的升高，有效酶濃度逐漸加大。當(dāng)?shù)孜锏臐舛染S持不變，有效酶濃度逐漸增多，從而起到抑制作用，使酶水解的不徹底，故水解得到的抗氧化肽減少，進(jìn)而導(dǎo)致DPPH清除率降低。

（3）綠豆多肽抗氧化性與pH的關(guān)系

本實驗在于研究酶法對綠豆蛋白水解的抗氧化肽的工藝優(yōu)化，故以DPPH為指標(biāo)，選擇酶解時間、酶解溫度、酶添加量以及pH為因素進(jìn)行單因素實驗。改變反應(yīng)pH，結(jié)果見3所示。
 

由上圖可知，當(dāng)pH在7.0～9.0時，DPPH的清除率隨著pH的增大逐漸增大，當(dāng)pH為9.00時，DPPH清除率達(dá)到最大值，為43.89％。當(dāng)pH超過9.0時，DPPH清除率逐漸減小。這是因為蛋白酶只有在一定的pH區(qū)間內(nèi)具有較高的活性，當(dāng)?shù)鞍酌柑幱谶^酸或過堿的條件下時蛋白酶的結(jié)構(gòu)會被破壞，導(dǎo)致部分蛋白無法完全水解，疏水基團(tuán)未完全暴露，使得生成肽的抗氧化涪陛降低。

（4）綠豆多肽抗氧化性與酶解時間的關(guān)系

通過單因素實驗的結(jié)果，可以篩選出各因素的三個水平。所以在此基礎(chǔ)之上，應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件建立4因素3水平的Box—Behnken模型，進(jìn)行回應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。改變酶解時間結(jié)果見4所示。

二、結(jié)果與討論

1、單因素實驗結(jié)果

（1）綠豆多肽抗氧化性與酶解溫度的關(guān)系

將綠豆蛋白配置成一定濃度的溶液，水浴加熱至100℃進(jìn)行15min均質(zhì)處理。待溶液冷卻至酶解最適溫度，水浴保溫，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH調(diào)節(jié)其pH，酶解一段時間后100℃水浴滅活10min，室溫下離心(4000r／min，20min)，將上清液凍干后保存。結(jié)果如圖l所示。

由圖1可知，當(dāng)酶解溫度低于50℃，DPPH清除率與溫度成正比，當(dāng)溫度超過50℃時，DPPH清除率開始下降。這是因為蛋白酶對穩(wěn)定的要求較高，溫度過低會影響酶解的反應(yīng)速度，使酶解反應(yīng)不徹底，從而影響抗氧化肽的抗氧化效果。而溫度過高則會影響蛋白酶的活性，使蛋白酶的活性降低，無法使蛋白水解成具有抗氧化性的小分子肽段，從而使DPPH清除率降低。

（2）綠豆多肽抗氧化性與酶濃度的關(guān)系

將2mL一定濃度的綠豆多肽溶液和2mL的0.12mm01·L^-1DPPH溶液進(jìn)行混合，避光于25℃條件下反應(yīng)30min，取出后于517nm波長下進(jìn)行吸光值的測定，此時吸光度值記錄為A_i；將上述過程中的2mLDPPH溶液用無水乙醇取代，然后與2mL綠豆多肽溶液進(jìn)行反應(yīng)，此條件下測定吸光值記錄為A_j，將2mL無水乙醇與2mLDPPH溶液反應(yīng)的條件作為空白組，此時記錄吸光值為Ao。結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)酶濃度低于6％時，DPPH清除率隨著酶濃度的增加而增大，當(dāng)酶濃度超過6％時，DPPH清除率隨著酶濃度的升高而降低。整體呈現(xiàn)先上升后下降的原因在于隨著酶濃度的升高，有效酶濃度逐漸加大。當(dāng)?shù)孜锏臐舛染S持不變，有效酶濃度逐漸增多，從而起到抑制作用，使酶水解的不徹底，故水解得到的抗氧化肽減少，進(jìn)而導(dǎo)致DPPH清除率降低。

（3）綠豆多肽抗氧化性與pH的關(guān)系

本實驗在于研究酶法對綠豆蛋白水解的抗氧化肽的工藝優(yōu)化，故以DPPH為指標(biāo)，選擇酶解時間、酶解溫度、酶添加量以及pH為因素進(jìn)行單因素實驗。

實驗條件進(jìn)行實驗，改變反應(yīng)pH，結(jié)果見3所示。

由上圖可知，當(dāng)pH在7.0～9.0時，DPPH的清除率隨著pH的增大逐漸增大，當(dāng)pH為9.00時，DPPH清除率達(dá)到最大值，為43.89％。當(dāng)pH超過9.0時，DPPH清除率逐漸減小。這是因為蛋白酶只有在一定的pH區(qū)間內(nèi)具有較高的活性，當(dāng)?shù)鞍酌柑幱谶^酸或過堿的條件下時蛋白酶的結(jié)構(gòu)會被破壞，導(dǎo)致部分蛋白無法完全水解，疏水基團(tuán)未完全暴露，使得生成肽的抗氧化涪陛降低。

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