鯰魚（Silvercarp，Hypophthalmichthysmolitrix），脊索動(dòng)物門、硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、鰱屬，是廣為人知的四大家魚之一，生產(chǎn)量?jī)H次鯉魚，2019年年銷售額381.0三萬t。鯰魚中包含充足的蛋白質(zhì)食物和多種多樣不飽和脂肪，包含8種必須氨基酸和組氨酸，在其中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的成分做到海水魚規(guī)范；鯰魚中還包含鉀、鈉、鈣、鎂、磷等常量元素及其鋅、硒、鐵等營(yíng)養(yǎng)元素。其肉薄刺多，腥味較重，銷售市場(chǎng)上主要是以活物的市場(chǎng)銷售為主導(dǎo)，一部分鯰魚被生產(chǎn)成冷凍品魚肉、飼料產(chǎn)品及蝦丸，利用率不高，還導(dǎo)致許多的廢棄物，污染環(huán)境，資源消耗比較嚴(yán)重，顧客接受度小于其他海產(chǎn)品。根據(jù)生產(chǎn)加工成魚漿產(chǎn)品，可增強(qiáng)其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

魚漿產(chǎn)品在凍藏全過程中容易腐壞霉變。其腐壞體制涉及到微生物、有機(jī)化學(xué)、物理學(xué)等轉(zhuǎn)變 ，在其中，微生物菌種是造成腐壞的首要要素，尤其是新穎和冷凍產(chǎn)品，因?yàn)槲唇?jīng)由高溫度解決或其他處理方法消毒殺菌，粘附在食物中的細(xì)菌生長(zhǎng)繁育，最后造成食品類腐壞霉變。Lücking等對(duì)369種腐壞的食品類試品的研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽胞鏈球菌和蕨類芽胞鏈球菌占主導(dǎo)性，還檢驗(yàn)到極少數(shù)的海面芽胞八疊革蘭陰性桿菌，與此同時(shí)證實(shí)蕨類芽胞鏈球菌具備一定的蛋白質(zhì)核糖核苷酸活力，可以溶解運(yùn)用蛋白。本精英團(tuán)隊(duì)過去的研究發(fā)現(xiàn)，蕨類枯草芽孢菌是導(dǎo)致鯰魚糜產(chǎn)品腐壞的優(yōu)點(diǎn)腐壞菌之一。1945年，法國(guó)Rose等在蕨類芽胞鏈球菌中發(fā)覺堿性蛋白酶，它是一類在偏堿情況下可以水解反應(yīng)蛋白肽鍵的抗氧化物。趙巧靈運(yùn)用差別蛋白組學(xué)技術(shù)性科學(xué)研究藍(lán)鰭金槍魚在冷凍歷程中的質(zhì)量轉(zhuǎn)變，魚類機(jī)構(gòu)胰蛋白酶加快肌原纖維構(gòu)造蛋白溶解全過程，毀壞魚類組織架構(gòu)，造成 魚類質(zhì)量降低。

本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用差別蛋白組學(xué)技術(shù)性科學(xué)研究蕨類芽胞鏈球菌堿性蛋白酶對(duì)鯰魚肌原纖維蛋白質(zhì)的溶解功效，找尋溶解全過程中的肌原纖維蛋白質(zhì)差別蛋白質(zhì)點(diǎn)，并運(yùn)用GO作用注解及KEEG通道剖析鯰魚肌原纖維蛋白質(zhì)微生物菌種溶解的方式，為將來鯰魚等海產(chǎn)品的微生物菌種腐壞科學(xué)研究帶來理論來源。

1原材料與方式

1.1原材料與實(shí)驗(yàn)試劑

活鯰魚購(gòu)于遼寧營(yíng)口市林南街水產(chǎn)市場(chǎng)，1h內(nèi)運(yùn)輸至試驗(yàn)室，馬上涼水至死。固相pH值梯度方向（immobilizedpHgradient，IPG）預(yù)制構(gòu)件干密封膠條（pH4～7，17cm）、媒介兩性關(guān)系電解質(zhì)溶液（pH3～10、pH5～8、pH4～6和pH5～7）、Ｔrisbase、苯甲基磺酰氟（PMSF）、尿素溶液、硫脲、二硫蘇糖醇（DＴＴ）、碘乙酰胺、3-[3-（膽氟苯丙基）二甲羥基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、聚合硫酸鐵凝膠電泳（PAGE）所需正丁酸、甲叉雙丙烯酰胺、十二甲基硝酸鈉（SDS）、礦物質(zhì)機(jī)油、四羥基乙二胺（ＴEMED）、過硫酸銨、甘氨酸均選購(gòu)自英國(guó)BioRad公司；凡士林、溴酚藍(lán)、瓊脂糖均為國(guó)內(nèi)分析純，全部水溶液均以Milli-Q超純水系統(tǒng)制取的超純水系統(tǒng)為有機(jī)溶劑。

1.2儀器設(shè)備與機(jī)器設(shè)備

5800MALDI-ＴO(shè)F/ＴO(shè)F質(zhì)譜儀器，ABSCIEX企業(yè)；UＶ-2550型紫外線由此可見光度計(jì)，日本安捷倫儀器企業(yè)；MILLI-QREFERENC超純水系統(tǒng)，英國(guó)密理博企業(yè)；GS-800-ＴM校準(zhǔn)型光密度掃描機(jī)，英國(guó)Bio-Rad公司；DL-1005型超低溫冷凍液循環(huán)，上海市漢諾儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；PROＴEANIEF等電對(duì)焦電泳儀，英國(guó)Bio-Rad公司；PROＴEAN83ⅡXL電泳槽，英國(guó)Bio-Rad公司；ZD-9556型水準(zhǔn)脫色搖床，常州市凱航儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；FE20pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；SORＶALLStratos冷藏離心機(jī)，英國(guó)Ｔhermo企業(yè)。

1.3實(shí)驗(yàn)方式

1.3.1原材料預(yù)備處理

1.3.1.1鯰魚肌原纖維蛋白質(zhì)獲取

參照李學(xué)鵬等的方式 ，取魚類20g并攪碎。添加5倍容積10mmol/L的Ｔris-HCl（pH7.2），快速勻質(zhì)2min，每過30s，停30s。在5000r/min、4℃標(biāo)準(zhǔn)下離心式15min。取沉積，在沉積中添加3倍大小的ＴrisHCl（含0.6mol/LNaCl，10mmol/LＴris，pH7.2）緩沖溶液，快速勻質(zhì)，后在4500r/min、4℃標(biāo)準(zhǔn)下離心式15min，雙縮脲測(cè)定方法其濃度值。取上清液儲(chǔ)藏在-80℃冰柜中預(yù)留。

1.3.1.2堿性蛋白酶解決

將干酶粉稀釋液至0.01g/mL，并取20mL肌原纖維蛋白質(zhì)水溶液，加上等同于蛋白品質(zhì)0.1%的偏堿胰蛋白酶酶液，放置磁力攪拌器上，各自在4℃和25℃下反映。堿性蛋白酶解決時(shí)間各自為：4℃選擇0，1，2h；25℃選擇0，0.5，1h。反映完成后馬上添加適量50mmol/LPMSF抑止酶活。

1.3.2雙向電泳

1.3.2.1等電對(duì)焦程序流程

參照Bio-Rad公司雙向電泳實(shí)際操作技術(shù)性指南及本精英團(tuán)隊(duì)早期已探究出鯰魚肌原纖維蛋白質(zhì)的雙重凝膠電泳技術(shù)性（twodimensionalgelelectrophoresis，2-DE）開展實(shí)驗(yàn)。將少量的已定量分析蛋白水溶液與凝固上樣緩沖溶液（含7mol/L尿素溶液、2mol/L硫脲、4%CHAPS、65mmol/LDＴＴ、0.2%媒介兩性關(guān)系電解質(zhì)溶液和0.001%溴酚藍(lán)）充足混和，選用17cm，pH4～7的IPG預(yù)制構(gòu)件干密封膠條開展等電對(duì)焦，100μg，300μL積極凝固上樣，著色方法為硝酸銀上色。等電對(duì)焦程序流程基本參數(shù)如表1所顯示。

1.3.2.2密封膠條均衡

等電對(duì)焦完畢后，每根密封膠條用6mL密封膠條均衡緩沖溶液Ⅰ〔6mol/L尿素溶液、2%SDS、0.375mol/LＴris-HCl（pH8.8）、20%凡士林和2%DＴＴ〕緩和中液Ⅱ[6mol/L尿素溶液、2%SDS、0.375mol/LＴris-HCl（pH8.8）、20%凡士林和2.5%碘乙酰胺]開展密封膠條均衡，每一次14min。

1.3.2.3第二向SDS-PAGE豎直凝膠電泳

將均衡結(jié)束的密封膠條于1×電級(jí)緩沖溶液（含3g/LＴrisbase、14.4g/L甘氨酸、1g/LSDS）中洗掉不必要平衡液，各自遷移至提早制完的第二向10%，12%，15%聚正丁酸分離出來膠上方，并添加低溶點(diǎn)瓊脂糖上膠液（0.5%低溶點(diǎn)瓊脂粉、25mmol/LＴris-base、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS和0.001%溴酚藍(lán)），清除汽泡，待其完全凝結(jié)后，遷移至垂直電泳槽中，恒流源開展第二向SDS-PAGE，程序流程見表2。

1.3.2.4銀染、凝膠成像及剖析

選用論文參考文獻(xiàn)的辦法并略微改動(dòng)。將銀染后的疑膠轉(zhuǎn)到GS-800疑膠掃描儀成像儀投影服務(wù)平臺(tái)上。

選用PDQuest8.0二維疑膠圖象技術(shù)專業(yè)分析系統(tǒng)對(duì)所述圖象開展環(huán)境削減、蛋白質(zhì)點(diǎn)檢驗(yàn)和配對(duì)等解決，找尋差別蛋白質(zhì)點(diǎn)。

1.3.3差別蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜分析評(píng)定

1.3.3.1酶解

參照Addis等和Bernevic等的方式 ，從銀染的疑膠上獲得蛋白點(diǎn)，放進(jìn)硅化解決過的1.5mL少量離心管架中，用超純水系統(tǒng)不斷浸洗后，對(duì)該蛋白質(zhì)點(diǎn)開展膠內(nèi)酶切。

1）褪色

在掛有蛋白質(zhì)點(diǎn)的移液管中，添加50μL褪色液[15mmol/LK3Fe（CN）6溶解50mmol/LNa2S2O3中]，將蛋白質(zhì)點(diǎn)的深棕色褪色至淺綠色，用超純水系統(tǒng)浸洗以停止反映，直到蛋白質(zhì)點(diǎn)變成沒有顏色全透明。隨后將蛋白質(zhì)點(diǎn)所依附的正丁酸剁碎，用100mmol/LNH4HCO3浸洗，并且用100%乙腈（色譜純）褪色至正丁酸疑膠色調(diào)泛白，接著將其放置冷藏真空干燥器中開展干凍。

2）酶解

用pH8.0的蛋白酶液（以50mmol/L硝酸鉀水溶液為有機(jī)溶劑）將干凍的試品于37℃酶解留宿。每一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)蛋白酶使用量依據(jù)蛋白質(zhì)點(diǎn)尺寸，每一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)約40～100ng蛋白酶。

3）提純

酶解后的肽段用60μL5%ＴFA和50%乙腈開展提純，反復(fù)2次，每一次15min，合拼提取液并真空泵排干。

4）試品復(fù)溶與除鹽

選用0.1%ＴFA水溶液將干躁后的試樣再度復(fù)溶，并且用ZipＴIP移液嘴除鹽。將1μL除鹽后的試品放置質(zhì)譜分析試品板上實(shí)現(xiàn)當(dāng)然干躁，開展MALDI-ＴO(shè)F/ＴO(shè)F剖析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)見表3。