參考KuSada等的方式 ,選用結(jié)晶紫染色法剖析蒜頭提取液對(duì)病菌生物膜系統(tǒng)產(chǎn)生工作能力的危害。將病菌細(xì)胞培養(yǎng)液按1∶1000的比率稀釋液,添加無(wú)菌檢測(cè)96填料中,添加不一樣含量的大蒜提取物(終濃度值為0.15~1.20mg/mL),30℃靜放塑造24h。清除細(xì)胞培養(yǎng)液,用無(wú)菌檢測(cè)雙蒸水清洗3次,無(wú)菌檢測(cè)風(fēng)干躁,添加200μL0.1%結(jié)晶紫上色液,室內(nèi)溫度上色15mIn,無(wú)菌水清洗3次,添加1mL95%酒精浸洗生物膜系統(tǒng),將洗劑于光波長(zhǎng)570nm處測(cè)量OD值。
參考PackIavaThy等的方式 ,運(yùn)用激光共聚焦光學(xué)顯微鏡(cLSm)剖析病菌生物膜結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。將病菌細(xì)胞培養(yǎng)液按1%的占比連接含1mLLB培養(yǎng)基的24填料中,添加1.20mg/mL大蒜提取物和直徑為1cm的環(huán)形蓋玻片,靜放塑造24h。用無(wú)菌水輕輕地清洗裝片上未黏附的體細(xì)胞,0.1%吖啶橙上色1mIn。洗去不必要的上色液,將蓋玻片置顯微鏡下觀查。該光學(xué)顯微鏡配有激起光波長(zhǎng)為515~560nm的激起濾光器及60×(60倍)的油鏡,其光學(xué)顯微鏡相片與電鏡相片均由FluovIewv5.0手機(jī)軟件得到
選用即時(shí)熒光定量PcR(RT-PcR)技術(shù)性。病菌活性后添加1.20mg/mL大蒜提取物塑造24h,運(yùn)用病菌RnA獲取檢測(cè)試劑盒獲取病菌RnA。在20μL反映系統(tǒng)中,添加10μL2×熒光定量PcR預(yù)混管理體系,0.4μL10μmol/L上、中下游引物設(shè)計(jì),2μLcDnA模版。PcR增加程序流程為:預(yù)轉(zhuǎn)性95℃3mIn,轉(zhuǎn)性95℃7S,淬火57℃10S,拓寬72℃15S(45個(gè)循環(huán)系統(tǒng))。相對(duì)性表述量(RQ)由2-ΔΔcT方式測(cè)算得到。
參考Zhao等的辦法制取無(wú)菌檢測(cè)魚漿汁水。冷藏魚漿解除凍結(jié)后,按質(zhì)量比1∶1放水磨漿,加溫?zé)_5mIn后靜放,制冷至室內(nèi)溫度。用2層沙布過慮得魚漿汁水,添加1.6g/L氧化三甲胺、40mg/LL-胱胺酸和40mg/LL甲硫氨酸,混和勻稱后于121℃高壓滅菌15mIn,得無(wú)菌檢測(cè)魚漿汁水。無(wú)菌檢測(cè)情況下,在魚漿汁水中加入不一樣濃度值的大蒜提取物(終濃度值為0.15~1.20mg/mL)。將制作好的病菌菌懸浮液注射至無(wú)菌檢測(cè)魚漿汁水中,于30℃中搖床塑造48h,每間距6h抽樣,測(cè)量魚漿汁水中TVB-n和腐胺成分轉(zhuǎn)變。
TVB-n的測(cè)量參考趙丹丹等的方式 ,取5mL試品,添加15mL0.6mol/L高氯酸水溶液勻質(zhì)攪拌,上清液用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)量。腐胺成分的測(cè)量參考Zhao等的方式 ,取2mL試品,添加25mL0.4mol/L高氯酸水溶液勻質(zhì)攪拌,上清液用丹磺酰氯衍化后用高效液相色譜色譜。
應(yīng)用SPSS21.0手機(jī)軟件和OrIgIn8.5手機(jī)軟件分析數(shù)據(jù)。測(cè)量結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n≥3)表明,選用最少明顯差別法(LSD)開展顯著性差異剖析,顯著性檢驗(yàn)為5%。
以根癌農(nóng)桿菌為匯報(bào)菌,運(yùn)用平行面劃線法剖析維氏氣單胞菌的AHLS分子結(jié)構(gòu)造成狀況,結(jié)果見圖1。病菌形成的AHLS可根據(jù)瓊脂粉蔓延誘發(fā)根癌農(nóng)桿菌造成β-半乳甘酶,并溶解底物X-gal造成深藍(lán)色黑色素。由圖1得知,維氏氣單胞菌可造成AHLS類信號(hào)分子并誘發(fā)根癌農(nóng)桿菌顯深藍(lán)色。
根癌農(nóng)桿菌對(duì)不一樣碳鏈的長(zhǎng)度或含有不一樣官能團(tuán)的AHLS分子結(jié)構(gòu)比較敏感層度不一樣,這種AHLS經(jīng)TLc進(jìn)行,在培養(yǎng)液相對(duì)應(yīng)的部位誘發(fā)根癌農(nóng)桿菌展現(xiàn)深藍(lán)色色斑。依據(jù)色斑的比移值、樣子和色調(diào)深、淺可直接分辨AHLS的類型及相對(duì)性成分。對(duì)維氏氣單胞菌的AHLS萃取液的TLc剖析結(jié)果見圖2。剖析得知,該病菌最少造成3種AHLS分子結(jié)構(gòu),即:c6-HSL、c7-HSL和c8-HSL。c4-HSL與c6-HSL是現(xiàn)階段氣單胞菌屬報(bào)導(dǎo)數(shù)最多的2種AHLS信號(hào)分子。LI等在腐壞比目魚中分離出來的柔和氣單胞菌中檢查到c4-HSL、c6-HSL、c8-HSL、N-癸酰基-高絲氨酸內(nèi)酯(c10-HSL)和n十二?;?高絲氨酸內(nèi)酯(c12-HSL)。本實(shí)驗(yàn)在維氏氣單胞菌中檢查到主鏈上的氧原子數(shù)量為質(zhì)數(shù)的AHL信號(hào)分子,即c7-HSL。
病菌形成的AHLS分子結(jié)構(gòu)濃度值受病菌相對(duì)密度轉(zhuǎn)變危害,不一樣發(fā)育環(huán)節(jié)的病菌AHLS萃取液能誘發(fā)根癌農(nóng)桿菌造成不一樣孔徑的深藍(lán)色圈。維氏氣單胞菌生長(zhǎng)發(fā)育歷程中的病菌數(shù)量與細(xì)胞培養(yǎng)液PH值的轉(zhuǎn)變見圖3,AHLS活力轉(zhuǎn)變見圖4。剖析得知,尿培養(yǎng)4h時(shí)處在多數(shù)成長(zhǎng)期前期,這時(shí)病菌代謝的AHLS可誘發(fā)根癌農(nóng)桿菌顯深藍(lán)色。在4~10h病菌的迅速成長(zhǎng)環(huán)節(jié),根癌農(nóng)桿菌的掉色直徑持續(xù)擴(kuò)大,表明AHLS的成分迅速積累。在10~18h時(shí),根癌農(nóng)桿菌深藍(lán)色圈的孔徑較大,這時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中AHLS濃度值最大。在18~48h,病菌處在生長(zhǎng)發(fā)育穩(wěn)定型,誘發(fā)匯報(bào)菌掉色的直徑減少,表明AHLS的濃度值逐漸減少。研究發(fā)現(xiàn),AHLS成分的降低與自然環(huán)境PH值上升相關(guān)。AHLS的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)在偏堿情況下構(gòu)造不穩(wěn)定,易解環(huán)。對(duì)病菌生長(zhǎng)發(fā)育歷程中細(xì)胞培養(yǎng)液的PH值轉(zhuǎn)變的分析表明:尿培養(yǎng)18h后細(xì)胞培養(yǎng)液的PH值由6.92升至8.11,塑造48h時(shí)PH值達(dá)8.97。伴隨著病菌的生長(zhǎng)發(fā)育,細(xì)胞培養(yǎng)液的PH值持續(xù)上升,AHLS逐漸溶解,活力減少。
革蘭氏陽(yáng)性菌陰性菌AHLS受體的人群磁感應(yīng)系統(tǒng)軟件主要是由luxRI的同源基因管控。運(yùn)用PcR技術(shù)指標(biāo)分析維氏氣單胞菌中的luxRI同源基因,結(jié)果見圖5a。剖析發(fā)覺兩個(gè)精彩片段編碼序列各自為基因表達(dá)管控因素AcuR和自誘發(fā)遺傳基因AcuI,這與JangId等的分析結(jié)果同樣,該專家學(xué)者初次在維氏氣單胞菌mTcc3249中檢查到AcuRI人群磁感應(yīng)系統(tǒng)軟件。除此之外,剖析維氏氣單胞菌的碳水化合物脫羧酶遺傳基因和感病遺傳基因,結(jié)果見圖5b、5c。鳥氨酸脫羧酶遺傳基因(ODC)和磷酸氫鈣脫羧酶遺傳基因(LDC)的驗(yàn)出表明該病菌具備產(chǎn)腐胺和尸胺的工作能力,胞內(nèi)酶遺傳基因(AhyB,ser,liP)的驗(yàn)出表明該菌具備一定的胰蛋白酶活力和淀粉酶活力,微絨毛遺傳基因(flA)的驗(yàn)出表明該菌具備微絨毛健身運(yùn)動(dòng)和產(chǎn)生生物膜系統(tǒng)的工作能力。
大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌的最少抗菌濃度值為2.5mg/mL(數(shù)據(jù)信息未表明)。本實(shí)驗(yàn)挑選小于此濃度值的系列產(chǎn)品(0,0.15,0.3,0.6,1.2mg/mL)來科學(xué)研究大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌人群磁感應(yīng)的影響功效。
根據(jù)檢驗(yàn)微生物匯報(bào)菌根癌農(nóng)桿菌的β-半乳糖苷酶促反應(yīng)來剖析不一樣濃度值大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌造成AHLS活力的影響功效,結(jié)果見圖6。剖析得知,伴隨著大蒜提取物濃度值的提升(0~1.20mg/mL),根癌農(nóng)桿菌的β-半乳糖苷酶促反應(yīng)持續(xù)減少(P<0.05)。這表明大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLS活力具備明顯的抑制效果(P<0.05),且大蒜提取物的濃度值與其說人群磁感應(yīng)抑止活力呈顯著量效關(guān)聯(lián)。大蒜提取物濃度值為1.20mg/mL時(shí)對(duì)根癌農(nóng)桿菌的β-半乳甘酶活力的抑制率最大,為39.6%。這有可能是由于此濃度值下維氏氣單胞菌AcuR蛋白質(zhì)與人群磁感應(yīng)抑止活性物質(zhì)的結(jié)合性最強(qiáng),抑止了AHLS分子結(jié)構(gòu)的基因表達(dá)表述。