梔子花是木犀科素馨花屬花香綠色植物,可用作茉莉茶的窨制和香辛料獲取。雙瓣茉莉是在我國梔子花種植的首要種類,其卡羅拉筒分成二輪,花朵雪白,生產(chǎn)量高,芬芳濃,是窨制茉莉茶的具體原材料,具備關(guān)鍵的經(jīng)濟(jì)價值；主莖抗旱性較強,便于種植,也是用以科學(xué)研究的滿意原材料。得到可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因水稻主莖盡管是科學(xué)研究綠色植物基因功能的主要方式,但因為用時長、成本增加、轉(zhuǎn)換管理體系不成熟等要素仍限定著現(xiàn)如今很多綠色植物種類的生物學(xué)科學(xué)研究。瞬間表述技術(shù)性融合報告基因的應(yīng)用為研究方案基因功能給予了迅速、高效率的方式,擬南芥、香煙、西紅柿、苞米原生質(zhì)細(xì)胞,香煙葉肉細(xì)胞,香煙BY-2體細(xì)胞及其圓蔥表皮細(xì)胞等受體的遺傳基因瞬間表述管理體系已被普遍使用于總體目標(biāo)基因表達(dá)、亞細(xì)胞定位、啟動子及蛋白質(zhì)活力檢驗、蛋白質(zhì)互作等基因功能科學(xué)研究剖析。目前植物細(xì)胞的瞬間轉(zhuǎn)換科學(xué)研究主要是聚集在方式綠色植物,在盆栽花卉綠色植物上的分析相比較少。殊不知,異源受體細(xì)胞對同一蛋白質(zhì)的表達(dá)作用很有可能存有差別,為了更好地使總體目標(biāo)基因表達(dá)物質(zhì)恰當(dāng)伸縮,裝飾并精確定位于對應(yīng)的亞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),挑選同宗植物細(xì)胞瞬間表述剖析可提升分析的精確性。

先人在茉莉花品種形狀特點、香味特點和單方精油獲取層面進(jìn)行了很多科學(xué)研究,但有關(guān)作用遺傳基因在細(xì)胞水平層面的探討很少,而有關(guān)梔子花原生質(zhì)體瞬間表述的辦法還末見報導(dǎo),因而創(chuàng)建梔子花原生質(zhì)體制取和轉(zhuǎn)換管理體系為廣泛開展梔子花細(xì)胞水平及分子結(jié)構(gòu)能力的作用基因組研究具備關(guān)鍵實際意義。本分析根據(jù)酶打法分離出來到很多有魅力的雙瓣茉莉花花朵原生質(zhì)體,應(yīng)用PEG受體的瞬間轉(zhuǎn)換管理體系,取得成功評定了3個梔子花來源于的總體目標(biāo)蛋白質(zhì)在原體細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位,為高通量測序進(jìn)行梔子花備選遺傳基因的功能設(shè)計打下基礎(chǔ)。

1 原材料與方式

1.1 實驗原材料

1.1.1 綠色植物原材料

梔子花供試原材料為自然條件下盆栽植物栽種的雙瓣茉莉,源自福建農(nóng)林高校梔子花種源圃。擬南芥供試原材料為澳大利亞生態(tài)化,由本試驗室人工氣候室培養(yǎng),生長發(fā)育標(biāo)準(zhǔn)為22℃,陽光照射13h(22℃),黑喑11h,光照度約80μmol·m^-2·s^-1,環(huán)境濕度60％。擬南芥種籽在4℃冷室春化48h后,挪到溫室大棚出芽,出芽后的種籽挪到陶粒上,按時灌溉1/4hoAG1AnD培養(yǎng)液。

1.1.2 質(zhì)粒

實驗常用媒介P35s-GFP來自體細(xì)胞表達(dá)載體P2FGW7(6666BP),表述框由花菜花葉病毒(CAmＶ)35s啟動子、翠綠色熒光蛋白(GFP)遺傳基因和煙脂堿合酶終止子(nos)組成。質(zhì)粒在大腸埃希菌dh5α菌種中增加后,很多獲取提純質(zhì)粒dnA,電泳原理評定并測量質(zhì)粒dnA濃度值和純凈度,D260nm/d280nm＝1.8～1.9,DnA濃度值為1μG·μ1^-1,-20℃儲存預(yù)留。

Js1hY-GFP、JssWEET1-GFP和JssWEET17-GFP媒介：Js1hY、JssWEET1和JssWEET17是福建農(nóng)林高校園藝花卉學(xué)校伍炳華研究組從梔子花花瓣CDnA中運用RACE引物設(shè)計分離出來復(fù)制到的3個遺傳基因,在其中Js1hY歸屬于mYB轉(zhuǎn)錄因子大家族的人體生物鐘1hY/CCA1的同宗編號遺傳基因；JssWEET1和JssWEET17歸屬于糖轉(zhuǎn)運蛋白sWEET大家族的2個編號遺傳基因。3個遺傳基因均已亞復(fù)制至體細(xì)胞表達(dá)載體P2GWF7(6670BP)的GFP開放閱讀框的閱讀文章框5'端,搭建了Js1hY-GFP、JssWEET1-GFP和JssWEET17-GFP媒介。

1.1.3 實驗試劑

關(guān)鍵實驗試劑有纖維素酶(CE11ｕ1AsE‘onoZｕKA’R10,YAKｕ1TPhARmACEｕTiCA1inDｕsTRY)、混凝土離析酶(mACERoZYmE‘onoZｕKA’R10,YAKｕ1TPhARmACEｕTiCA1inDｕsTRY)、果膠酶(PECTinAsE,siGmA)、牛血清蛋白(BsA,siGmA)、mEs(siGmA)、PEG4000(siGmA)、二甲酸熒光素(F1ｕoREsCEindiACETATE,FDA,siGmA)、碘化丙啶(PRoPiDiｕmioDiDE,Pi,siGmA)。其他基本上實驗試劑均購自生工生物企業(yè)。

1.2 外植體原材料的解決

參考YooETA1的方式 ,選擇生長發(fā)育5～6周的擬南芥出葉中徹底屈伸的葉子,或當(dāng)然盆栽植物下三年生梔子花主莖的葉子,用單層刀頭將葉子切割成寬約0.5～1.0mm的細(xì)條,與酶液充足攪拌后,開展原生質(zhì)體分離出來。

本實驗還采用綻放的梔子花花朵做為分離出來原生質(zhì)體的酶解原材料,并參考YooETA1、WｕETA1和ZhEnGETA1的方式 ,選用不一樣的處理方法,文中取名為切條法、膠撕法和磨紗法,較為對梔子花花朵原生質(zhì)體分離出來效果的危害。選擇3～5朵新鮮對外開放的花瓣0.1～0.4G,選用不一樣的處理方法使花朵體細(xì)胞曝露：A切條法,用刮刀將花朵切割成總寬為0.5～1.0mm細(xì)條條；B膠撕法,用透明膠帶黏住花朵正反兩面,輕輕地撕下粘在下外皮上的膠布,使花朵體細(xì)胞曝露；C磨紗法,用特細(xì)石英沙輕輕地磨擦花朵下外皮,導(dǎo)致外皮輕度損壞顯現(xiàn)出花朵體細(xì)胞。解決后的花朵機構(gòu)馬上挪到酶液中,開展原生質(zhì)體分離出來,每一個解決實驗設(shè)定3個分子生物學(xué)反復(fù),各自統(tǒng)計分析花朵原生質(zhì)體生產(chǎn)量和活力。

1.3 原生質(zhì)體的剝離方式

葉子或花朵原生質(zhì)體的配制方式參考YooETA1的方式 ,并略做改動,將解決后的綠色植物原材料泡浸于含15G·1^-1纖維素酶和4G·1^-1混凝土離析酶的酶解液中,酶有機溶劑為20mmol·1^-1KC1,0.4mol·1^-1甘油果糖,20mmol·1^-1mEsPh5.7,10mmol·1^-1CAC12和1G·1^-1BsA的溶液,真空包裝解決30min后,在25℃黑喑情況下靜放酶解4h,以后放置水準(zhǔn)震蕩器內(nèi)以200R·min^-1的轉(zhuǎn)速比波動10min,使原生質(zhì)體充足釋放出來到酶解液中。向酶解溶液中添加等大小的W5水溶液(154mmol·1^-1nAC1,125mmol·1^-1CAC12,5mmol·1^-1KC1,2mmol·1^-1mEsPh5.7),經(jīng)200目沙布過慮后,于200G,4℃離心式3min,棄上清搜集原生質(zhì)體,以后再添加2m1的W5,靜放冰面40min,清除上清后,添加2m1W5水溶液重懸,測量原生質(zhì)體總產(chǎn)量。

為提升末莉花朵原生質(zhì)體的剝離高效率,將切條法處置后的花朵機構(gòu)放置含一定濃度梯度纖維素酶或果膠酶的酶解液中,黑喑情況下酶解3～6h,在顯微鏡下統(tǒng)計分析原生質(zhì)體生產(chǎn)量和致死率,明確合適的酶液組成和酶解時間,實驗反復(fù)3次。應(yīng)用熒光染料Pi檢驗原生質(zhì)體的致死率。向100μ1搜集的原生質(zhì)體中添加1μ1Pi水溶液(100μG·m1^-1)攪拌,取10μ1至蓋玻片上,在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計分析一個視線中傳出鮮紅色瑩光數(shù)據(jù)信號的原生質(zhì)體數(shù)量和白光燈視線下原生質(zhì)體的總數(shù)量,觀查視線5～10個,原生質(zhì)體致死率/％＝(發(fā)鮮紅色瑩光的體細(xì)胞數(shù)/原生質(zhì)體數(shù)量)×100。

1.4 原生質(zhì)體的總產(chǎn)量與活力測量

生產(chǎn)量測量：根據(jù)血球計數(shù)板記數(shù)。搜集的原生質(zhì)休重懸在W5水溶液中,取小量滴于0.1mm血球計數(shù)板上,在顯微鏡下觀查,選擇膜結(jié)構(gòu)工程詳細(xì)的原生質(zhì)體記數(shù),每一個試品記數(shù)3個反復(fù),取均值,統(tǒng)計分析原生質(zhì)體生產(chǎn)量?；煲褐性|(zhì)體濃度值/(個·m1^-1)＝血球計數(shù)板均值每一個大格子(0.1mm3,即0.1μ1)的原生質(zhì)體數(shù)量×104。原生質(zhì)體生產(chǎn)量,即1克生物量原材料所得的的原生質(zhì)體數(shù)量/(個·G^-1)＝原生質(zhì)體的濃度值(個·m1^-1)×飄浮原生質(zhì)體的W5水溶液容積(m1)/花朵品質(zhì)(G)。

活力測量：選用FDA活物染色法。每100μ1飄浮的原生質(zhì)體中添加1μ1FDA上色液(5mG·m1^-1融解于甲苯),取10μ1放置蓋玻片上,在光學(xué)顯微鏡下檢測其活力,魅力高的原生質(zhì)體在瑩光下顯微鏡下可傳出淺綠色瑩光。

1.5 原生質(zhì)體的瞬間轉(zhuǎn)換

將沉積后的原生質(zhì)體用mmG水溶液(0.4mol·1^-1甘油果糖,15mmol·1-1mGC12,4mmol·1^-1mEsPh5.7)重懸,使其含量做到2×10五個·m1^-1,用以PEG受體的基因遺傳轉(zhuǎn)換。每100μ1原生質(zhì)體試品與10μ1外源性質(zhì)粒dnA(1μG·μ1^–1)及其110μ1PEG水溶液[400G·1^-1PEG4000,0.2mol·1^-1甘油果糖,0.1mol·1^-1CAC12]充足混合后,室內(nèi)溫度靜放5min,添加440μ1W5水溶液中止反映,200G離心式棄上清.用100μ1W1水溶液(0.5mol·1^-1甘油果糖,20mmol·1^-1KC1,4mmol·1^-1mEsPh5.7)重懸原生質(zhì)體,22℃黑喑情況下塑造12～16h,可觀查原生質(zhì)體轉(zhuǎn)換高效率或總體目標(biāo)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。

為改進(jìn)末莉花朵原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)換高效率,將分離純化后的花朵原生質(zhì)休重懸成不一樣含量的細(xì)胞液,向轉(zhuǎn)換管理體系中添加不一樣量的P35s-GFP質(zhì)粒dnA,與等大小的不一樣濃度值的PEG水溶液柔和攪拌,使轉(zhuǎn)換機制的PEG終濃度值分別為50、100、150、200和250G·1-1,室內(nèi)溫度靜放各自解決2、5、10、15和30min,轉(zhuǎn)換后的原生質(zhì)體在黑暗中孵育16h,在顯微鏡下統(tǒng)計分析轉(zhuǎn)換高效率,實驗反復(fù)3次.轉(zhuǎn)換高效率檢驗:向100μ1轉(zhuǎn)換后的原生質(zhì)體添加1μ1Pi水溶液,取10μ1至蓋玻片上,在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計分析一個視線中傳出鮮紅色瑩光數(shù)據(jù)信號的原生質(zhì)體數(shù)量,表述翠綠色熒光蛋白的原生質(zhì)體數(shù)量和白光燈視線下原生質(zhì)體的總數(shù)量,觀查視線5～10個,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)換高效率/％＝[發(fā)翠綠色瑩光的原生質(zhì)體數(shù)/(原生質(zhì)體數(shù)量-Pi上色發(fā)鮮紅色瑩光的體細(xì)胞數(shù))]×100。

1.6 共聚焦顯微鏡觀察體細(xì)胞精準(zhǔn)定位

含總體目標(biāo)遺傳基因的瞬間表達(dá)載體轉(zhuǎn)到原生質(zhì)體,孵育16h后,從管底汲取10μ1原生質(zhì)體水溶液放置蓋玻片上,用1EiCATCssP8激光共聚焦顯微鏡觀察總體目標(biāo)基因表達(dá)狀況。用以觀查GFP數(shù)據(jù)信號的熒光激起光的波長為488nm,發(fā)送光波長為505～535nm；觀查葉綠體自發(fā)性瑩光的激起光的波長為633nm,發(fā)送光波長為647～685nm。