(5)抗菌成分的胰蛋白酶水解作用試驗(yàn)
選用兩層瓊脂粉蔓延法,將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進(jìn)無(wú)菌檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中,待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液,每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無(wú)菌檢測(cè)牛津杯,將0.1mL濃度值為l×108CFU/mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45~50℃的LB固體培養(yǎng)基中,當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上,留意不能加到牛津杯里,待其徹底凝結(jié),做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯,留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼,向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS,37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后,精確測(cè)量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌,與此同時(shí)用鹽水做為對(duì)比。選擇抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種作事后科學(xué)研究抗菌試驗(yàn)中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種CFS,各自調(diào)整pn為胰蛋白酶K、胃蛋白酶和蛋白酶的適宜功效pH,按1.0mg/mL各自添加胰蛋白酶K(適宜pH7.0)、胃蛋白酶(適宜pH2.0)、蛋白酶(適宜pH7.0),37℃下溫育1h,將CFS的pH調(diào)返回5.0,牛津杯法精確測(cè)量其抑菌圈直徑,反復(fù)3次,以沒經(jīng)胰蛋白酶解決過的pH=5.0的CFS為對(duì)比。認(rèn)證乳酸菌飲料CFS的抗菌活性物質(zhì)是不是為蛋白質(zhì)類。
(6)乳酸菌飲料組織學(xué)特點(diǎn)觀查
選用兩層瓊脂粉蔓延法,將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進(jìn)無(wú)菌檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中,待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液,每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無(wú)菌檢測(cè)牛津杯,將0.1mL濃度值為l×108CFU/mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45~50℃的LB固體培養(yǎng)基中,當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上,留意不能加到牛津杯里,待其徹底凝結(jié),做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯,留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼,向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS,37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后,精確測(cè)量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌,與此同時(shí)用鹽水做為對(duì)比。抗菌試驗(yàn)中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種注射于MRS固態(tài)平板電腦上四劃分線,37℃厭氧發(fā)酵塑造48h,觀查固態(tài)平板電腦上的菌體形狀特點(diǎn)并挑菌單菌體開展革蘭氏染色試驗(yàn),鏡檢查觀查菌體上色結(jié)果和組織學(xué)特點(diǎn)。
(7)菌種鑒定
①生理學(xué)生物化學(xué)評(píng)定試驗(yàn)
參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》中的實(shí)驗(yàn)方法,選用兩層瓊脂粉蔓延法,將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進(jìn)無(wú)菌檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中,待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液,每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無(wú)菌檢測(cè)牛津杯,將0.1mL濃度值為l×108CFU/mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45~50℃的LB固體培養(yǎng)基中,當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上,留意不能加到牛津杯里,待其徹底凝結(jié),做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯,留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼,向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS,37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后,精確測(cè)量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌,與此同時(shí)用鹽水做為對(duì)比??咕囼?yàn)中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種開展生理學(xué)生物化學(xué)評(píng)定。
②16SrRNA遺傳基因保守序列增加
選用兩層瓊脂粉蔓延法,將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進(jìn)無(wú)菌檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中,待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液,每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無(wú)菌檢測(cè)牛津杯,將0.1mL濃度值為l×108CFU/mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45~50℃的LB固體培養(yǎng)基中,當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上,留意不能加到牛津杯里,待其徹底凝結(jié),做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯,留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼,向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS,37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后,精確測(cè)量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌,與此同時(shí)用鹽水做為對(duì)比。
將抗菌試驗(yàn)中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種開展病菌基因的獲取,依照已買病菌DNA獲取檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明試驗(yàn)操作流程開展。
③菌種鑒定并搭建系統(tǒng)軟件進(jìn)化樹
取5μL增加精彩片段100V工作電壓下,1%瓊脂糖電泳原理觀查結(jié)果(尺寸應(yīng)是1500bp上下)。認(rèn)證后的電泳條帶膠回收利用檢測(cè)試劑盒回收利用,回收利用物質(zhì)送上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。將菌種16SrRNA高通量測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查詢中已經(jīng)知道菌種保守序列開展核對(duì),根據(jù)MEGAX手機(jī)軟件剖析目地基因序列的開放閱讀框,并搭建系統(tǒng)發(fā)育樹。
4、數(shù)據(jù)處理方法
每一個(gè)試驗(yàn)3個(gè)平行面,數(shù)據(jù)信息用x–±s表明。
二、結(jié)果與剖析
1、乳酸菌飲料菌種分離出來(lái)
從安徽省當(dāng)?shù)厮岵酥袊?guó)共產(chǎn)黨分離出來(lái)得到10個(gè)溶鈣圈的乳白色單菌體,經(jīng)初始評(píng)定得到6株乳酸菌飲料,進(jìn)一步挑選提純后依照菌種來(lái)源于和挑菌次序取名。
2、抗菌試驗(yàn)結(jié)果
抗菌試驗(yàn)結(jié)果如圖所示1所顯示,菌種PC-3對(duì)2種指示菌抑菌圈直徑較大,抗菌實(shí)際效果最好是,對(duì)大腸埃希菌和金黃鏈球菌的抑菌圈直徑各自做到17.17 0.42mm和19.23±0.61mm。結(jié)果顯示該菌種對(duì)大腸埃希菌和金黃鏈球菌有極強(qiáng)的殺菌作用。緣故可能是乳酸菌飲料在成長(zhǎng)新陳代謝的環(huán)節(jié)中形成了有機(jī)物、H202或病菌素,進(jìn)而控制了標(biāo)示病菌的生長(zhǎng)發(fā)育。挑選PC-3號(hào)菌種做為事后試驗(yàn)菌種。
3、菌種PC-3生長(zhǎng)曲線圖和產(chǎn)酸曲線圖的測(cè)量
菌種PC-3生長(zhǎng)曲線圖和產(chǎn)酸曲線圖如圖2所顯示,該菌種在0~12h處在延滯期,生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,延滯期相比較長(zhǎng)。菌種PC-3在12h后進(jìn)到對(duì)數(shù)期,菌體細(xì)胞快速繁衍生長(zhǎng)發(fā)育,在36h菌體細(xì)胞數(shù)做到最高值。在菌體進(jìn)到多數(shù)成長(zhǎng)期后菌液的pH快速減少,穩(wěn)定型時(shí)pH保持在4.0上下。
4、有機(jī)物和雙氧水清除抗菌試驗(yàn)結(jié)果
菌種PC-3CFS對(duì)二種指示菌的抑制效果,可能是菌種PC-3新陳代謝生成的病菌素或酸堿性尾端物質(zhì)如有機(jī)物或雙氧水功效的結(jié)果。如圖所示3所顯示,pH=5.0的菌種Pc-3CFS與初始CFS抗菌實(shí)際效果對(duì)比,對(duì)大腸埃希菌和金黃鏈球菌的抑菌圈直徑各自降低了7.0%和6.6%,表明pH=5.0的菌種Pc-3CFS與初始CFS抗菌實(shí)際效果相仿,事后實(shí)驗(yàn)中抗菌實(shí)際效果比較能夠 pH=5.0做為pH調(diào)整標(biāo)準(zhǔn);pH=5.0的乳酸菌和甲酸對(duì)照實(shí)驗(yàn)對(duì)二種指示菌的抑菌圈直徑顯著減少,抗菌實(shí)際效果非常明顯變?nèi)酰砻髑宄樗峋图姿岬挠绊懞?,CFS中還出現(xiàn)別的抗菌化學(xué)物質(zhì),菌種PC-3CFS中起關(guān)鍵殺菌作用的化學(xué)物質(zhì)并不是有機(jī)物類。