肉食品中傷害最大的細菌是瘦臉針梭狀枯草芽孢菌通稱肉毒梭菌，該菌在厭氧發(fā)酵環(huán)鏡中可造成肉毒毒素，肉毒毒素毒副作用比氰化鉀強一萬倍。因為肉毒梭菌造成的肉毒毒素的有毒毒副作用，世界各地都容許肉毒梭菌緩聚劑一亞硝酸鈉做為食用添加劑在肉類食品中限定應(yīng)用。亞硝酸鈉在肉類食品中能夠顯著抑止瘦臉針梭狀枯草芽孢菌造成內(nèi)毒素。可是近幾十年來，亞硝酸鈉已變成食品衛(wèi)生安全異議的聚焦點。由于在一定情況下（例如高溫），肉食品中殘存的亞硝酸鈉能夠 與分散碳水化合物和丙烯胺反映，轉(zhuǎn)化成痕量元素N-亞硝酸。小動物及臨床流行病學(xué)科學(xué)研究結(jié)果顯示N-亞硝酸是強致癌物質(zhì)。

次磷酸鈉能夠 控制革蘭氏陽性綠膿桿菌（包含肉毒梭菌），可以處理肉食品產(chǎn)品質(zhì)量難點，而且中國次磷酸鈉生產(chǎn)工藝及水準持續(xù)提升 ，具有了生產(chǎn)制造食品級不銹鋼次磷酸鈉的工作能力，現(xiàn)階段早已到系統(tǒng)的、全方位的科學(xué)研究次磷酸鈉取代亞硝酸鈉的機會。次磷酸鈉是一種比較理想的工業(yè)級氧化劑，關(guān)鍵用以化學(xué)鍍鎳、電鍍工藝、有機化學(xué)工業(yè)生產(chǎn)、食品工業(yè)和冷藏、橡膠制品增稠劑。對于次磷酸鈉的殺菌作用，海外科研工作人員己經(jīng)開始科學(xué)研究次磷酸鈉抑止肉毒梭菌的實際效果，嘗試做為亞硝酸鈉抗菌劑的替代品，獲得不錯進度。Rhodehamel等覺得次磷酸鈉口感上很柔和，無刺激性味，對肉類食品的顏色和抗氧化層面沒什么副作用，此外，次磷酸鈉是不確定性的一種好的抗菌劑，而且在1990年被審批為安全性化學(xué)物質(zhì)（GRAS）。Woodetal和PeggandShahidi試驗說明，次磷酸鈉添加到肉漿中，針對肉毒菌素的抑止是合理的。

本科學(xué)研究用不一樣含量的次磷酸鈉（下稱SHP）水溶液對肉食品中常用的六種有危害菌（生孢梭菌、脹氣莢膜梭、菌沙門菌、大腸埃希菌、橙黃色鏈球菌、蠟樣枯草芽孢菌）開展抗菌解決，根據(jù)對照實驗與對照組抑菌圈尺寸比照，分辨SHP對六種菌的抗菌實際效果；并且以有抗菌實際效果的菌苗為研究對象，探尋SHP的最少抗菌濃度值；進一步探索SHP抑止肉毒梭菌的最好抗菌標準。

依據(jù)《病原微生物實驗室生物安全管理條例》歸類標準，瘦臉針梭狀枯草芽孢菌歸屬于試驗室二級毒副作用菌，為高致病微生物，對科學(xué)研究工作人員的生命安全有一定威協(xié)，不宜試驗室工作人員立即科學(xué)研究，因為生孢梭菌的危險較小，而且其特性特點與肉毒梭菌極為類似，因此 許多專家教授用生孢梭菌替代肉毒梭菌開展科學(xué)研究。因而，本畢業(yè)論文全部實驗均以肉毒梭菌的科學(xué)研究取代菌生孢梭菌來進行科學(xué)研究。

一、原材料與方式

1、原材料與實驗試劑

次磷酸鈉（SHP）：純凈度≥99.8％，阿拉丁有限責(zé)任公司；生孢梭菌CICC（10385）干凍粉、脹氣莢膜梭菌CICC（22949）干凍粉、蠟樣枯草芽孢菌CMCC（B）63301干凍粉；

大腸埃希菌0157（EPEC）、沙門菌（阿貢納）、橙黃色鏈球菌ATCC（6538）、純凈水、液體石蠟、厭氧發(fā)酵帶；

加強梭菌培養(yǎng)液、PCA、LB骨頭湯培養(yǎng)液、加強梭菌瓊脂粉；

碳酸鈉AR。

2、儀器設(shè)備與機器設(shè)備

超凈工作臺、恒溫箱、電冰箱、厭氧罐、光度計。

3、實驗方法

（1）SHP梯度方向液的配置

抗菌實際效果試驗SHP水溶液配置：

取七個500mL容量瓶清洗殺菌，各自型號1～7。各自配置0mg/L、250mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L規(guī)范SHP水溶液，混勻。取7支整潔已殺菌試管嬰兒在無菌車間中每一個試管嬰兒各自放入不一樣含量的SHP水溶液10mL，型號，橡膠塞殺菌塞緊，預(yù)留，切勿將水溶液先裝進試管嬰兒隨后變道殺菌。最少抗菌濃度值探尋SHP水溶液配置：

跟上面一樣解決方式各自配置0mg/L、2000mg/L、2200mg/L、2400mg/L、2600mg/L、2800mg/L、3000mg/L規(guī)范SHP水溶液。

（2）培養(yǎng)液的配置

加強梭菌培養(yǎng)液：稱量本產(chǎn)品38.0g，加溫拌和融解于1000mL純凈水中，散裝多個試管嬰兒中10mL，滴進適當(dāng)液體石蠟封閉式液位，變道后121℃高壓滅菌15min，預(yù)留。

LB骨頭湯培養(yǎng)液、PCA、加強梭菌瓊脂粉：按表明稱量相對應(yīng)本產(chǎn)品，加溫拌和融解于1000mL純凈水中，散裝10個三角瓶中，121℃高壓滅菌15min，預(yù)留。

（3）菌種活化與菌液配置

生孢梭菌、脹氣莢膜梭菌：超凈工作臺中，用燒紅制冷的接種環(huán)將菌苗連接加強梭菌培養(yǎng)液試管嬰兒中活性24h；依照GB測菌落總數(shù)，將原菌液適度稀釋液操縱菌液濃度值大約在105上下。

沙門菌、大腸埃希菌、橙黃色鏈球菌、蠟樣枯草芽孢菌：超凈工作臺選用燒紅制冷的接種環(huán)將菌苗連接裝有10mLLB的三角瓶中活性24h；依照GB測菌落總數(shù)（大約在2.37×108），將原菌液適度稀釋液操縱菌液濃度值大約在106上下。

（4）抑菌圈的測量

生孢梭菌、脹氣莢膜梭菌抑菌圈的測量：

殺菌夾層玻璃培養(yǎng)皿底端區(qū)劃地區(qū)并序號1～7→倒平板每一個培養(yǎng)皿20mL→每一個平板電腦加100μL菌液施膠勻稱一每一個地區(qū)中間放上一個殺菌的牛津杯一每一個牛津杯里添加200μL相匹配序號的SHP水溶液一蓋好外蓋后放進厭氧罐中并放進厭氧發(fā)酵帶一封好厭氧罐外蓋移進恒溫箱。做多個平行面試驗，36℃下塑造24h，精確測量抑菌圈。

大腸埃希菌、沙門菌、橙黃色鏈球菌、蠟樣枯草芽孢菌抑菌圈的測量：殺菌夾層玻璃培養(yǎng)皿底端區(qū)劃地區(qū)序號1～7→移液器汲取1mL菌液各自進入到培養(yǎng)皿中→加溫溶化PCA制冷至40～50℃倒平板→每一個地區(qū)中間放上一個殺菌的牛津杯→每一個牛津杯里用移液器添加200μL相匹配序號的SHP水溶液→蓋好外蓋移進恒溫箱。做多個平行面試驗，36℃下塑造24h，精確測量抑菌圈。

（5）SHP對肉毒梭菌、脹氣莢膜梭菌最少抗菌濃度值的測量

活性后原菌液混勻→散裝到7支試管嬰兒中每一個100μL一各自添加1～花了7天時間SHP水溶液lOmL→混勻滴進適當(dāng)液體石蠟封閉式，36℃下塑造24h→取7支殺菌整潔比色皿→各自添加1～花了7天時間菌液（混勻）→600nm下測其OD值明確MIC。

（6）生孢梭菌的最好抑止標準測量

SHP對身孢梭菌抑止關(guān)鍵受溫度、時間、pH要素的危害，挑選L9（34）正交實驗，方案設(shè)計如下所示。

取9個殺菌整潔夾層玻璃培養(yǎng)皿各自序號1～9→倒平板每一個培養(yǎng)皿20mL→用移液器每一個平板電腦加IOOμL菌液于培養(yǎng)液表層涂抹勻稱→每一個培養(yǎng)皿里放上三個殺菌的牛津杯→每一個牛津杯里添加相對應(yīng)pH的SHP水溶液200μL蓋好外蓋→放進厭氧罐中開啟厭氧發(fā)酵袋封住外蓋→同一塑造溫度的對照組移進相匹配的恒溫箱→精確測量各對照組抑菌圈直徑尺寸，照相，紀錄，數(shù)據(jù)分析。對檢測結(jié)果開展數(shù)據(jù)分析，找到最好組成，進而明確SHP對身孢梭菌的最好抑止標準。

（7）數(shù)據(jù)信息數(shù)據(jù)分析

每一組試驗反復(fù)3次測量，選用SPSSl9.0統(tǒng)計分析軟件對信息完成數(shù)據(jù)分析及顯著性分析，數(shù)據(jù)信息選用標準偏差表明。

二、結(jié)果與探討

1、SHP對肉食品中的普遍有危害菌的抗菌實際效果

本分析挑選肉食品中常用的傷害菌，包含革蘭氏陽性菌、脹氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、橙黃色鏈球菌、蠟樣枯草芽孢菌；革蘭氏陽性菌陰性菌：沙門菌、腸子埃希氏菌，科學(xué)研究次磷酸鈉對每一種病菌是不是有控制實際效果。不一樣含量的SHP對肉食品中的六種有危害菌開展解決，選用牛津杯法，見圖1，仔細觀察抑菌圈的形成狀況來判斷SHP對六種菌的抗菌實際效果，及其隨SHP濃度值轉(zhuǎn)變的抗菌發(fā)展趨勢。抑菌圈的尺寸展現(xiàn)了SHP抗菌實際效果的高低，抑菌圈越大表明SHP的抗菌作用越好。

圖1中，牛津杯的外直徑為8.0mm。下列實驗中解決的試品要是沒有超過8.00mm的清楚的抑菌圈，視作沒有殺菌作用。