羊肚菌是四大名貴食用菌之一，因其菌蓋表面有許多不規(guī)則凹陷且多有褶皺，狀似羊肚而得名，主要分布在云南、貴州、青海、西藏等地。羊肚菌肉質(zhì)鮮美，風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、多糖等物質(zhì)，有提高免疫力、抗癌等藥用價(jià)值。氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單元和人體的所需營養(yǎng)成分，具有多種不同的生理功能，能判斷食品的營養(yǎng)價(jià)值，同樣也關(guān)聯(lián)和影響食品的風(fēng)味，是食品質(zhì)量評價(jià)的重要指標(biāo)，所以羊肚菌中氨基酸的含量是衡量羊肚菌品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。

在國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.124-2016中，測定氨基酸采用外標(biāo)法，吳素蕊、張航、黃世群等對羊肚菌氨基酸的研究多數(shù)均采用外標(biāo)法，但該方法不能消除實(shí)驗(yàn)中的誤差以及標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品之間的基體差異所導(dǎo)致的基質(zhì)效應(yīng)，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度有一定影響；內(nèi)標(biāo)法由于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和待測組分來自同一基體，當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件發(fā)生非人為變化時(shí)，兩者會受到相同影響，消除了系統(tǒng)誤差，使分析更加準(zhǔn)確。為了更好地評價(jià)羊肚菌的品質(zhì)，需對羊肚菌中氨基酸的含量進(jìn)行全面、準(zhǔn)確的控制，但檢測物質(zhì)較多，成本過高且耗時(shí)過長。QAMS法通過測定一個成分而實(shí)現(xiàn)多個成分的同步測定，大幅度降低成本和實(shí)驗(yàn)人員的工作量，比傳統(tǒng)質(zhì)量控制方法更加經(jīng)濟(jì)、高效、簡單。

本研究采用一測多評法測定羊肚菌中17種氨基酸的含量，并對云南、新疆、貴州等6個不同地區(qū)的羊肚菌測定研究，本文為衡量羊肚菌的食用價(jià)值和品質(zhì)優(yōu)劣提供了科學(xué)依據(jù)，為羊肚菌的開發(fā)利用指明了方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌采集于新疆伊犁州、云南麗江市、貴州劍河縣、貴州銅仁市萬山區(qū)、貴州貴陽市長坡嶺森林公園、貴州貴陽市烏當(dāng)區(qū)長坡六個地區(qū)，羊肚菌置于干燥箱70℃烘干后，粉碎處理，過60目篩，粉末密封待用；甲醇、乙腈、三乙胺、正己烷　均為色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；異硫氰酸酯（PITC）純度大于98%，上海麥克林生化科技有限公司；乙酸銨、冰醋酸　均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水　自制；18種氨基酸[天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、丙氨酸（Ala）、甲硫氨酸（Met）、賴氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）、絲氨酸（Ser）、茶氨酸（The）]　純度均大于98%，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。
Agilent1100高效液相色譜儀（方法學(xué)考察所用）、Agilent1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；DZKW-電熱恒溫水浴鍋，天津天泰儀器有限公司；200T粉碎機(jī)，永康鉑歐五金制品有限公司；AL-104電子天平，梅特勒-托利多公司；CH-250超聲波清洗機(jī)，北京創(chuàng)新德超聲電子研究所；DiscoveryDV215CD分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；202-1型恒溫干燥箱　上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 內(nèi)標(biāo)溶液

精密稱取茶氨酸，配制濃度為0.404mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

精確稱取Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys等17種氨基酸至10mL容量瓶中，加水定容得到混標(biāo)儲備液。移取1mL混標(biāo)儲備液和0.5mL內(nèi)標(biāo)溶液于5mL容量瓶，加水定容，得到0.0397、0.0496、0.0218、0.0208、0.0078、0.1017、0.0311、0.0447、0.0277、0.0182、0.0207、0.0061、0.0184、0.0263、0.0170、0.0181、0.0446mg/mL的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.1.3 衍生化試劑

衍生試劑A：取1.4mL1mol/L的三乙胺溶液至10mL容量瓶，用乙腈定容，搖勻；衍生試劑B：吸取125μLPITC至10mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，搖勻。

1.2.2 樣品溶液制備與衍生化

1.2.2.1 樣品溶液與空白溶液制備

準(zhǔn)確稱取20mg羊肚菌于安瓿瓶中，加6.0mol/L的HCl溶液2mL，吹入氮?dú)夂竺芊?，將其置于?05±5）℃恒溫干燥箱中24h，使氨基酸完全水解。取出冷卻后置80℃水浴揮干，多次加水揮發(fā)鹽酸。加1mL蒸餾水溶解，超聲后得到樣品溶液。將0.5mL的內(nèi)標(biāo)溶液和樣品溶液移加至5mL容量瓶，加水定容，得到樣品供試溶液，等待衍生。吸取0.5mL的內(nèi)標(biāo)溶液加至5mL容量瓶，加水定容，得空白溶液。

1.2.2.2 氨基酸的衍生化

精密吸取200μL的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（或樣品供試溶液、空白液）于離心管中，加入衍生試劑A、B各100μL，置40℃水浴鍋中反應(yīng)1h，加入400μL正己烷，振蕩靜置10min。取澄清的下層液，過0.45μm濾膜，即得待測樣品。

1.2.3 色譜條件

分離柱為依利特HypersilODS2（5μm，250mm×4.6mm）；流動相A：0.05mol/L乙酸銨溶液（pH6.5）；流動相B：乙腈；梯度洗脫（0min，0.8%B；14min，5%B；16min，6%B；16.1min，4%B；21min，4%B；21.1min，3.5%B；30min，3.5%B；32min，8%B；40min，15%B；40.1min，16.5%B；44min，16.5%B；44.1min，20.8%B；50min，23%B；60min，25%B）；流速為1mL/min；檢測波長為254nm；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為5μL；
1.2.4一測多評方法學(xué)考察

1.2.4.1 線性考察

精確吸取0.25、0.5、1、2、4mL的混標(biāo)儲備液，分別置于5mL容量瓶，再分別加入0.5mL內(nèi)標(biāo)溶液，加水定容，搖勻，進(jìn)行衍生化處理，按上述的色譜進(jìn)樣測定。以氨基酸對照品的濃度（mg/mL）為X軸，峰面積為Y軸進(jìn)行線性回歸

1.2.4.2 相對校正因子的計(jì)算

平行取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液6份，進(jìn)行衍生化處理，按上述的色譜條件測定。以Glu為內(nèi)參物，根據(jù)相對校正因子（RCF，f_km）公式fkm=（C_k×A_m）/（C_m×A_k），計(jì)算相對校正因子，式中C_k、C_m為內(nèi)參物和待測成分的濃度，A_m、A_k為內(nèi)參物和待測成分的峰面積。

1.2.4.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行衍生化處理后按上述的色譜條件連續(xù)測定6次，記錄17種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面積，計(jì)算RSD值以評價(jià)儀器的精密度。

相關(guān)鏈接：纈氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，冰醋酸

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