泡菜是浸泡于食鹽含量為2％～8％的鹵水中，依靠蔬菜自身攜帶乳酸菌厭氧發(fā)酵而成的一類發(fā)酵蔬菜制品的總稱，目前用于泡菜制作的蔬菜主要包括蘿卜、辣椒、白菜、青菜和豇豆等，其中酸豇豆因營(yíng)養(yǎng)成分齊全、口感脆爽且風(fēng)味獨(dú)特而成為我國(guó)泡菜的重要組成部分。在泡菜發(fā)酵過(guò)程中，鹵水中微生物群系的變化直接決定了泡菜風(fēng)味品質(zhì)的形成，因而國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)泡菜中微生物的多樣性開展了相對(duì)系統(tǒng)的研究，多數(shù)研究均證實(shí)Leuconostocmesenteroides，(腸膜明串珠菌)、Leuconostocmesentoroides(植物乳桿菌)和pediococcuspentosaceus(戊糖片球菌)為泡菜中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。

近年來(lái)隨著健康意識(shí)的提升，消費(fèi)者越來(lái)越傾向于低鹽豇豆泡菜，而自然發(fā)酵的酸豇豆是最易發(fā)生軟腐、產(chǎn)生酸敗味和“生花”的泡菜之一。較之自然發(fā)酵，乳酸菌純種發(fā)酵的豇豆質(zhì)地變化快且成熟周期短，同時(shí)風(fēng)味較純正，因而在對(duì)酸豇豆中乳酸菌進(jìn)行分離鑒定的基礎(chǔ)上，積極開展具有優(yōu)良發(fā)酵特性乳酸菌菌株的篩選，進(jìn)而推動(dòng)酸豇豆發(fā)酵模式的改變具有積極的意義。作為華中地區(qū)重要的“動(dòng)植物基因庫(kù)”，恩施土家族苗族自治州位于鄂、湘和渝三省(市)交匯處，境內(nèi)森林覆蓋率近70％，居住著漢族、土家族、苗族和侗族等眾多少數(shù)民族。恩施土家族苗族自治州恩施市居民歷來(lái)有制作和食用酸豇豆的習(xí)俗，因而該地酸豇豆中亦可能蘊(yùn)含著豐富的乳酸菌資源。

本研究對(duì)采集自恩施市酸豇豆中乳酸菌的多樣性進(jìn)行了解析，在對(duì)其蘊(yùn)含的乳酸菌資源進(jìn)行分離鑒定和保藏的基礎(chǔ)上，使用電子鼻和電子舌技術(shù)對(duì)L.plantarum脅塒加純種發(fā)酵酸豇豆的品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以期為后續(xù)具有優(yōu)良酸豇豆發(fā)酵特性乳酸菌的篩選提供菌株支持。

一、材料與方法

1、材料與試劑

酸豇豆采集自恩施土家苗族自治州恩施市舞陽(yáng)壩菜市場(chǎng)和土橋壩菜市場(chǎng)；MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammoniumbromide，CTAB)、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、碳酸鈣、十二烷基硫酸鈉、甘油、過(guò)氧化氫、氯仿、飽和酚和異戊醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；10×PCRBuffer、rTaq酶和dNTPmix，北京全式金生物技術(shù)有限公司；正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1495R(5’-CTACGGCTACCTrGTTACGA-3’)，由武漢天一輝遠(yuǎn)有限公司合成；AxygenPcR清潔試劑盒，康寧生命科學(xué)吳江有限公司。

2、儀器與設(shè)備

DG250厭氧工作站，英國(guó)DWS公司；ECLIPSECi生物顯微鏡，日本Nikon公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)，美國(guó)NanoDrop公司；DYY-12電泳儀，北京六一儀器廠；UVPcDs8000凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Proteinsimple公司；vetiri梯度基因擴(kuò)增儀，美國(guó)AB公司；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；HwS24型恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SA402B味覺分析系統(tǒng)，日本INSENT公司；PEN3型電子鼻，德國(guó)Airsense公司；BS224S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PGJ-10-AS純水儀，武漢品冠儀器設(shè)備有限公司。

3、檢測(cè)與分析方法

（1）酸豇豆中潛在乳酸菌菌株的分離

采用倍比稀釋的方法對(duì)酸豇豆樣品中的菌群進(jìn)行稀釋，選取合適濃度的稀釋液涂布于含有1.0％碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中，在氮?dú)?/span>、氫氣和二氧化碳體積比為85:10:5的厭氧工作站中37℃培養(yǎng)48h。選取形態(tài)大小不同且有透明圈的單菌落進(jìn)行分離并進(jìn)行3代純化，最終將過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)為陰性且革蘭氏染色為陽(yáng)性的菌株定義為潛在乳酸菌菌株，并使用甘油保藏后置于-80℃冰箱備用。

（2）酸豇豆中潛在乳酸菌菌株的鑒定

將潛在乳酸菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后3000r/min離心10min收集菌體，使用CTAB法進(jìn)行基因組DNA提取，并以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，正向和反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq酶，1μLDNA模板和18.3μL無(wú)菌水。PCR擴(kuò)增條件為：95℃4min；95℃45s，55℃45s，72℃90s，循環(huán)30次；72℃10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后使用1.0％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增效果進(jìn)行檢測(cè)，上樣量為2.5μL。同時(shí)使用清潔試劑盒將擴(kuò)增產(chǎn)物清潔后，進(jìn)行克隆鑒定，并選取陽(yáng)性克隆送往武漢天一輝遠(yuǎn)有限公司進(jìn)行測(cè)序，反饋回的序列經(jīng)拼接后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，依據(jù)序列同源性選取與相似度≥99％的模式菌株確定種屬關(guān)系，并使用MEGA7.O軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

（3）L.plantarum純種發(fā)酵酸豇豆的制作

將豇豆洗凈瀝干后切成長(zhǎng)約5cm的小段放入2L玻璃泡菜壇中，同時(shí)按照每250g豇豆添加35.5g食鹽和600mL純凈水的比例進(jìn)行酸豇豆的制備。按照5×10⁶/g豇豆的比例接入將潛在乳酸菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后3000r/min離心10min收集菌體，使用CTAB法進(jìn)行基因組DNA提取，并以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，正向和反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq酶，1μLDNA模板和18.3μL無(wú)菌水。PCR擴(kuò)增條件為：95℃4min；95℃45s，55℃45s，72℃90s，循環(huán)30次；72℃10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后使用1.0％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增效果進(jìn)行檢測(cè)，上樣量為2.5μL。攪拌均勻后泡菜壇口水封，置培養(yǎng)箱中中30℃發(fā)酵7d。同時(shí)以未接入乳酸菌的酸豇豆作為對(duì)照組，且將其定義為自然發(fā)酵組。

（4）L.plantarum純種發(fā)酵酸豇豆品質(zhì)的評(píng)價(jià)

將豇豆洗凈瀝干后切成長(zhǎng)約5cm的小段放入2L玻璃泡菜壇中，同時(shí)按照每250g豇豆添加35.5g食鹽和600mL純凈水的比例進(jìn)行酸豇豆的制備。按照5×10⁶/g豇豆的比例接入將潛在乳酸菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后3000r/min離心10min收集菌體，使用CTAB法進(jìn)行基因組DNA提取，并以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，正向和反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq酶，1μLDNA模板和18.3μL無(wú)菌水。PCR擴(kuò)增條件為：95℃4min；95℃45s，55℃45s，72℃90s，循環(huán)30次；72℃10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后使用1.0％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增效果進(jìn)行檢測(cè)，上樣量為2.5μL。攪拌均勻后泡菜壇口水封，置培養(yǎng)箱中中30℃發(fā)酵7d。發(fā)酵好的酸豇豆?jié){水300r/min離心10min取上清，使用SA402B電子舌參照王玉榮的方法進(jìn)行酸、苦、澀、咸和鮮5個(gè)基本味及后味-A、后味-B和豐度3個(gè)回味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度的測(cè)定，進(jìn)而評(píng)價(jià)L.plantarum純種發(fā)酵對(duì)酸豇豆滋味品質(zhì)的影響。

亦取豇豆洗凈瀝干后切成長(zhǎng)約5cm的小段放入2L玻璃泡菜壇中，同時(shí)按照每250g豇豆添加35.5g食鹽和600mL純凈水的比例進(jìn)行酸豇豆的制備。按照5×10⁶/g豇豆的比例接入將潛在乳酸菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后3000r/min離心10min收集菌體，使用CTAB法進(jìn)行基因組DNA提取，并以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，正向和反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq酶，1μLDNA模板和18.3μL無(wú)菌水。PCR擴(kuò)增條件為：95℃4min；95℃45s，55℃45s，72℃90s，循環(huán)30次；72℃10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后使用1.0％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增效果進(jìn)行檢測(cè)，上樣量為2.5μL。攪拌均勻后泡菜壇口水封，置培養(yǎng)箱中中30℃發(fā)酵7d。發(fā)酵好的酸豇豆?jié){水直接裝入15mL樣品瓶中，55℃水浴10min后室溫平衡20min，參照楊成聰?shù)姆椒ㄊ褂肞EN3電子鼻10組金屬氧化物傳感器對(duì)各敏感物質(zhì)的響應(yīng)值進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而評(píng)價(jià)L.plantarum純種發(fā)酵對(duì)酸豇豆風(fēng)味品質(zhì)的影響。

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