1.3.6 生物膜系統(tǒng)產(chǎn)生工作能力的測量

參考KuSada等的方式 ，選用結晶紫染色法剖析蒜頭提取液對病菌生物膜系統(tǒng)產(chǎn)生工作能力的危害。將病菌細胞培養(yǎng)液按1∶1000的比率稀釋液，添加無菌檢測96填料中，添加不一樣含量的大蒜提取物（終濃度值為0.15～1.20mg/mL），30℃靜放塑造24h。清除細胞培養(yǎng)液，用無菌檢測雙蒸水清洗3次，無菌檢測風干躁，添加200μL0.1%結晶紫上色液，室內(nèi)溫度上色15mIn，無菌水清洗3次，添加1mL95%酒精浸洗生物膜系統(tǒng)，將洗劑于光波長570nm處測量OD值。

參考PackIavaThｙ等的方式 ，運用激光共聚焦光學顯微鏡（cLSm）剖析病菌生物膜結構的轉變。將病菌細胞培養(yǎng)液按1%的占比連接含1mLLB培養(yǎng)基的24填料中，添加1.20mg/mL大蒜提取物和直徑為1cm的環(huán)形蓋玻片，靜放塑造24h。用無菌水輕輕地清洗裝片上未黏附的體細胞，0.1%吖啶橙上色1mIn。洗去不必要的上色液，將蓋玻片置顯微鏡下觀查。該光學顯微鏡配有激起光波長為515～560nm的激起濾光器及60×（60倍）的油鏡，其光學顯微鏡相片與電鏡相片均由FluovIewv5.0手機軟件得到

1.3.7 基因的表達量的測量

選用即時熒光定量PcR（RT-PcR）技術性。病菌活性后添加1.20mg/mL大蒜提取物塑造24h，運用病菌RnA獲取檢測試劑盒獲取病菌RnA。在20μL反映系統(tǒng)中，添加10μL2×熒光定量PcR預混管理體系，0.4μL10μmol/L上、中下游引物設計，2μLcDnA模版。PcR增加程序流程為：預轉性95℃3mIn，轉性95℃7S，淬火57℃10S，拓寬72℃15S（45個循環(huán)系統(tǒng)）。相對性表述量（RQ）由2-ΔΔcT方式測算得到。

1.3.8 病菌腐壞工作能力的測量

參考Zhao等的辦法制取無菌檢測魚漿汁水。冷藏魚漿解除凍結后，按質(zhì)量比1∶1放水磨漿，加溫燒開5mIn后靜放，制冷至室內(nèi)溫度。用2層沙布過慮得魚漿汁水，添加1.6g/L氧化三甲胺、40mg/LL-胱胺酸和40mg/LL甲硫氨酸，混和勻稱后于121℃高壓滅菌15mIn，得無菌檢測魚漿汁水。無菌檢測情況下，在魚漿汁水中加入不一樣濃度值的大蒜提取物（終濃度值為0.15～1.20mg/mL）。將制作好的病菌菌懸浮液注射至無菌檢測魚漿汁水中，于30℃中搖床塑造48h，每間距6h抽樣，測量魚漿汁水中TVB-n和腐胺成分轉變 。

TVB-n的測量參考趙丹丹等的方式 ，取5mL試品，添加15mL0.6mol/L高氯酸水溶液勻質(zhì)攪拌，上清液用全自動凱氏定氮儀測量。腐胺成分的測量參考Zhao等的方式 ，取2mL試品，添加25mL0.4mol/L高氯酸水溶液勻質(zhì)攪拌，上清液用丹磺酰氯衍化后用高效液相色譜色譜。

1.4 數(shù)據(jù)信息數(shù)據(jù)分析

應用SPSS21.0手機軟件和OrIgIn8.5手機軟件分析數(shù)據(jù)。測量結果以平均值±標準偏差（n≥3）表明，選用最少明顯差別法（LSD）開展顯著性差異剖析，顯著性檢驗為5%。

2 結果與剖析

2.1 維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLs信號分子的類型

以根癌農(nóng)桿菌為匯報菌，運用平行面劃線法剖析維氏氣單胞菌的AHLS分子結構造成狀況，結果見圖1。病菌形成的AHLS可根據(jù)瓊脂粉蔓延誘發(fā)根癌農(nóng)桿菌造成β-半乳甘酶，并溶解底物X-gal造成深藍色黑色素。由圖1得知，維氏氣單胞菌可造成AHLS類信號分子并誘發(fā)根癌農(nóng)桿菌顯深藍色。

根癌農(nóng)桿菌對不一樣碳鏈的長度或含有不一樣官能團的AHLS分子結構比較敏感層度不一樣，這種AHLS經(jīng)TLc進行，在培養(yǎng)液相對應的部位誘發(fā)根癌農(nóng)桿菌展現(xiàn)深藍色色斑。依據(jù)色斑的比移值、樣子和色調(diào)深、淺可直接分辨AHLS的類型及相對性成分。對維氏氣單胞菌的AHLS萃取液的TLc剖析結果見圖2。剖析得知，該病菌最少造成3種AHLS分子結構，即：c6-HSL、c7-HSL和c8-HSL。c4-HSL與c6-HSL是現(xiàn)階段氣單胞菌屬報導數(shù)最多的2種AHLS信號分子。LI等在腐壞比目魚中分離出來的柔和氣單胞菌中檢查到c4-HSL、c6-HSL、c8-HSL、N-癸?；?高絲氨酸內(nèi)酯（c10-HSL）和n十二?；?高絲氨酸內(nèi)酯（c12-HSL）。本實驗在維氏氣單胞菌中檢查到主鏈上的氧原子數(shù)量為質(zhì)數(shù)的AHL信號分子，即c7-HSL。

2.2 維氏氣單胞菌生長發(fā)育歷程中AHLs活力轉變

病菌形成的AHLS分子結構濃度值受病菌相對密度轉變 危害，不一樣發(fā)育環(huán)節(jié)的病菌AHLS萃取液能誘發(fā)根癌農(nóng)桿菌造成不一樣孔徑的深藍色圈。維氏氣單胞菌生長發(fā)育歷程中的病菌數(shù)量與細胞培養(yǎng)液PH值的轉變 見圖3，AHLS活力轉變 見圖4。剖析得知，尿培養(yǎng)4h時處在多數(shù)成長期前期，這時病菌代謝的AHLS可誘發(fā)根癌農(nóng)桿菌顯深藍色。在4～10h病菌的迅速成長環(huán)節(jié)，根癌農(nóng)桿菌的掉色直徑持續(xù)擴大，表明AHLS的成分迅速積累。在10～18h時，根癌農(nóng)桿菌深藍色圈的孔徑較大 ，這時細胞培養(yǎng)液中AHLS濃度值最大。在18～48h，病菌處在生長發(fā)育穩(wěn)定型，誘發(fā)匯報菌掉色的直徑減少，表明AHLS的濃度值逐漸減少。研究發(fā)現(xiàn)，AHLS成分的降低與自然環(huán)境PH值上升相關。AHLS的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)在偏堿情況下構造不穩(wěn)定，易解環(huán)。對病菌生長發(fā)育歷程中細胞培養(yǎng)液的PH值轉變的分析表明：尿培養(yǎng)18h后細胞培養(yǎng)液的PH值由6.92升至8.11，塑造48h時PH值達8.97。伴隨著病菌的生長發(fā)育，細胞培養(yǎng)液的PH值持續(xù)上升，AHLS逐漸溶解，活力減少。

2.3 維氏氣單胞菌的遺傳基因剖析

革蘭氏陽性菌陰性菌AHLS受體的人群磁感應系統(tǒng)軟件主要是由luxRI的同源基因管控。運用PcR技術指標分析維氏氣單胞菌中的luxRI同源基因，結果見圖5a。剖析發(fā)覺2個精彩片段編碼序列各自為基因表達管控因素AcuR和自誘發(fā)遺傳基因AcuI，這與ＪangId等的分析結果同樣，該專家學者初次在維氏氣單胞菌mTcc3249中檢查到AcuRI人群磁感應系統(tǒng)軟件。除此之外，剖析維氏氣單胞菌的碳水化合物脫羧酶遺傳基因和感病遺傳基因，結果見圖5b、5c。鳥氨酸脫羧酶遺傳基因（ODC）和磷酸氫鈣脫羧酶遺傳基因（LDC）的驗出表明該病菌具備產(chǎn)腐胺和尸胺的工作能力，胞內(nèi)酶遺傳基因（AhyB，ser，liP）的驗出表明該菌具備一定的胰蛋白酶活力和淀粉酶活力，微絨毛遺傳基因（flA）的驗出表明該菌具備微絨毛健身運動和產(chǎn)生生物膜系統(tǒng)的工作能力。

2.4 大蒜提取物對維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLs的抑制效果

大蒜提取物對維氏氣單胞菌的最少抗菌濃度值為2.5mg/mL（數(shù)據(jù)信息未表明）。本實驗挑選小于此濃度值的系列產(chǎn)品（0，0.15，0.3，0.6，1.2mg/mL）來科學研究大蒜提取物對維氏氣單胞菌人群磁感應的影響功效。

根據(jù)檢驗微生物匯報菌根癌農(nóng)桿菌的β-半乳糖苷酶促反應來剖析不一樣濃度值大蒜提取物對維氏氣單胞菌造成AHLS活力的影響功效，結果見圖6。剖析得知，伴隨著大蒜提取物濃度值的提升（0～1.20mg/mL），根癌農(nóng)桿菌的β-半乳糖苷酶促反應持續(xù)減少（P＜0.05）。這表明大蒜提取物對維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLS活力具備明顯的抑制效果（P＜0.05），且大蒜提取物的濃度值與其說人群磁感應抑止活力呈顯著量效關聯(lián)。大蒜提取物濃度值為1.20mg/mL時對根癌農(nóng)桿菌的β-半乳甘酶活力的抑制率最大，為39.6%。這有可能是由于此濃度值下維氏氣單胞菌AcuR蛋白質(zhì)與人群磁感應抑止活性物質(zhì)的結合性最強，抑止了AHLS分子結構的基因表達表述。