(5)雜交瘤細(xì)胞塑造與抗原的分離出來(lái)取挑選出的呈陽(yáng)性雜交瘤體細(xì)胞在CO₂恒溫箱中開(kāi)展離體塑造，從細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出來(lái)單抗?；虿捎肂ALB/c小白鼠或其等位基因小白鼠，首先用4-羥基十五烷或液體石蠟開(kāi)展腹部注入，1星期過(guò)后將雜交瘤細(xì)胞注射到小白鼠腹部中。注射1星期過(guò)后搜集小白鼠的肝腹水，分離出來(lái)肝腹水中的單抗。

3、抗原提純單抗的提純方式與多克隆抗體的提純方式相近。現(xiàn)階段最有效的單抗的提純方式是免疫力親和力色譜分析，該法將鏈球菌A蛋白質(zhì)或抗小白鼠人免疫球蛋白與適度媒介(最常見(jiàn)的是Sepharose)化學(xué)交聯(lián)，制取免疫力親和力離子交換柱，將抗原融合后過(guò)柱，利用率可以達(dá)到90％之上。

(四)標(biāo)識(shí)物的制取與提純

半抗原、抗原和抗體的標(biāo)識(shí)依據(jù)選定的標(biāo)識(shí)免疫力統(tǒng)計(jì)分析方法不一樣，采用不一樣的標(biāo)識(shí)物。如酶聯(lián)免疫吸咐測(cè)定方法(ELISA)常見(jiàn)的標(biāo)識(shí)物有辣根乳酸脫氫酶(horseradish Deroxidase，HRP)、偏堿磷酸酯酶(alkaline phosptlatase，AP)等，流動(dòng)性注入免疫力剖析(FIIA)常見(jiàn)的標(biāo)識(shí)有魯米諾等，(ABS)系統(tǒng)軟件常用的標(biāo)識(shí)物為生物素，金標(biāo)免疫力剖析使用的標(biāo)識(shí)物為納米金。

1、半抗原的標(biāo)識(shí)與提純

半抗原的標(biāo)識(shí)依標(biāo)識(shí)物的類別和半抗原的活力官能團(tuán)不一樣使用不一樣標(biāo)識(shí)方式。如用辣根乳酸脫氫酶標(biāo)識(shí)含分散羥基的半抗原，一般 選用碳二亞胺法、活力酯法或混和酸酐法。用辣根乳酸脫氫酶標(biāo)識(shí)帶有分散羥基的半抗原可選用戊二醛法、二異硫氰酸酯法等。必須特別注意的是，辣根乳酸脫氫酶催化反應(yīng)氯丁二烯釋放出來(lái)臭氧，一些物理性質(zhì)不足平穩(wěn)、非常容易被氧化的半抗原(如酚類等)在與辣根乳酸脫氫酶共價(jià)鍵耦聯(lián)的歷程中需要留意遮光避氧，避免 半抗原被氧化后造成 相對(duì)應(yīng)抗原無(wú)法識(shí)別。

酶標(biāo)半抗原的提純可選用分析、超濾膜離心分離。小分子標(biāo)記物標(biāo)識(shí)的半抗原可選用薄層色譜、柱色譜分析分離純化。

2、抗原體的標(biāo)識(shí)與提純

抗原體的標(biāo)識(shí)視抗原體的類別和性能而定。在化肥免疫力剖析中，常用的抗原體是人造的(半抗原與載體蛋白的耦聯(lián)物)，因而標(biāo)識(shí)物能夠標(biāo)識(shí)在人力抗原體的載體蛋白上。蛋白類抗原體的標(biāo)識(shí)、提純，與抗原的標(biāo)識(shí)、提純方式相近。

3、抗原的標(biāo)識(shí)與提純

抗原的標(biāo)識(shí)依據(jù)標(biāo)識(shí)物的差異使用不一樣的標(biāo)注方式。辣根乳酸脫氫酶標(biāo)識(shí)抗原常選用改進(jìn)的過(guò)碘酸鹽法，將要辣根乳酸脫氫酶分子結(jié)構(gòu)中糖的醇羥基空氣氧化成醛基后與抗原的分散羥基共價(jià)鍵耦聯(lián)。分子結(jié)構(gòu)中含分散羧基(如生物素等)、分散羥基的標(biāo)識(shí)物(如辣根乳酸脫氫酶)與抗原的耦聯(lián)方式類似含分散羧基、羥基的半抗原與載體蛋白的共價(jià)鍵耦聯(lián)。含脂環(huán)伯胺的標(biāo)識(shí)物，選用重氮化法與抗原分子結(jié)構(gòu)中色氨酸殘基的酚羥基鄰位產(chǎn)生甲酰胺鍵連接。含丙烯酸酯構(gòu)造的標(biāo)識(shí)物可與抗原的分散羥基立即耦聯(lián)。為避免 標(biāo)識(shí)物耦聯(lián)在抗原的抗原體相接處而造成 抗原的病毒學(xué)活力減少，可選用馬來(lái)酰亞胺類活力酯等辦法將標(biāo)識(shí)物與多肽鏈抗原的巰基共價(jià)鍵聯(lián)接，由于抗原的抗原體相接處沒(méi)有巰基。納米金標(biāo)識(shí)抗原則選用物理學(xué)粘附法。

因?yàn)闃?biāo)識(shí)物的分子大小不一樣，標(biāo)識(shí)抗原的提純方式也不一樣。如標(biāo)識(shí)物為小分子水化學(xué)物質(zhì)，標(biāo)識(shí)抗原的提純可選用分析、離心式超濾膜法。若標(biāo)識(shí)物為生物大分子(如辣根乳酸脫氫酶)，標(biāo)識(shí)抗原的提純一般選用Sephadex疑膠柱色譜分析。如用小分子標(biāo)記物標(biāo)識(shí)半抗原，可選用薄層色譜、硅橡膠柱色譜分析分離純化。

(五)免疫力剖析新技術(shù)的確立與標(biāo)準(zhǔn)提升

1、抗原和抗體的濃度值挑選

抗原和抗體反映中，抗原的濃度值需與抗原體濃度值相一致，一般 選用矩陣測(cè)驗(yàn)法挑選抗原和抗體的最佳濃度值組成。

(1)間接性市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸咐測(cè)定方法中被子原和抗原濃度值的挑選，針對(duì)問(wèn)接市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸咐測(cè)定方法，被子原和抗原濃度值的選用流程如下所示。

①被子：將被子原用pH 9.6的硫化物緩沖溶液倍比稀釋液成一定的濃度值系列產(chǎn)品，100μL/孔，被子酶標(biāo)板不一樣的行，空白試驗(yàn)孔加等容積緩沖溶液，4℃下吸咐留宿。

②封閉式：次日傾去被子液，清洗除去分散物，加封閉液150μL/孔，37℃下封閉式1.5 h。清洗除去分散物。

③反映：將抗原用適度pH的聚磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer，PB)倍比稀釋液至一定濃度值系列產(chǎn)品添加酶標(biāo)板的不一樣列，100μL/孔，37℃下反映1～1.5 h。清洗除去分散物。

④加酶標(biāo)二抗：將酶標(biāo)二抗稀釋液至工作中濃度值，加至酶標(biāo)板，100μL/TL，37℃下反映1～1.5 h。清洗除去分散物。

⑤著色測(cè)量：加底物與鉻黑T溶液100μL/孔，37℃下遮光反映15 min。加50μL/孔終止劑停止反映，在酶標(biāo)儀上測(cè)量各孔的吸光度值。

各自以被子原濃度值和抗原濃度值為橫坐標(biāo)軸、以吸光度數(shù)值縱軸做圖。挑選吸光度值約為1.0抗原和抗體濃度值都較低、處在吸光度曲線圖轉(zhuǎn)折點(diǎn)處的抗原和抗體濃度值為適宜濃度值組成。

(2)包被抗原立即市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸咐測(cè)定方法中被子原和酶標(biāo)抗原濃度值的選取在包被抗原立即市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸咐測(cè)定方法中，被子原和酶標(biāo)抗原濃度值的選用流程如下所示。

①被子：將被子原用pH 9.6的硫化物緩沖溶液倍比稀釋液成一定的濃度值系列產(chǎn)品，被子酶標(biāo)板的不一樣行，100μL/TL，空白試驗(yàn)孔加等容積緩沖溶液，4℃下吸咐留宿。

⑦封閉式：次日傾去被子液，清洗除去分散物，加封閉液150μL/TL，37℃下封閉式1.5 h。清洗除去分散物。

③反映：將酶標(biāo)抗原倍比稀釋液成工作中濃度值系列產(chǎn)品，加至酶標(biāo)板的不一樣列，100μL/孔，37℃下反映1～1.5h。清洗除去分散物。

④著色測(cè)量：加底物與鉻黑T溶液100μL/孔，37℃下遮光反映15min，加終止劑50μL/孔停止反映，在酶標(biāo)儀上測(cè)量各孔的吸光度值。

各自以被子原濃度值和酶標(biāo)抗原濃度值為橫坐標(biāo)軸、以吸光度數(shù)值縱軸做圖。挑選吸光度值約為1.0處在吸光度曲線圖轉(zhuǎn)折點(diǎn)處的被子原和酶標(biāo)抗原濃度值為適宜濃度值組成。

(3)被子抗原立即市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸咐測(cè)定方法中抗原和酶標(biāo)半抗原濃度值的選取在被子抗原立即市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸咐測(cè)定方法中，抗原和酶標(biāo)半抗原濃度值的選用流程如下所示。

①被子：將抗原用適度pH的聚磷酸鹽緩沖溶液倍比稀釋液成一定的濃度值系列產(chǎn)品并被子酶標(biāo)板的不一樣行，100μL/TL，空白試驗(yàn)孔加等容積聚磷酸鹽緩沖溶液，4℃下吸咐留宿。

②封閉式：次日傾去被子液，清洗除去分散物，加封閉液150 μL/TL，37℃下封閉式1.5 h。清洗除去分散物。

③反映：將酶標(biāo)半抗原用磷酸緩沖溶液倍比稀釋液成一定濃度值系列產(chǎn)品并加至酶標(biāo)板的不一樣列，100μL/TL，37℃下反映1～1.5 h。清洗除去分散物。