木耳做為一種寶貴的傳統(tǒng)式服用細(xì)菌，不但能為身體給予碳水化合物、蛋白、膳食纖維素等營(yíng)養(yǎng)元素，還有著抗氧化性、抗癌、降血脂和避免心腦血管疾病等各種活力作用。木耳帶有各種營(yíng)養(yǎng)元素，在其中所含含糖量成份的功能科學(xué)研究相對(duì)普遍，尤其是在食品類和保健產(chǎn)品開發(fā)設(shè)計(jì)領(lǐng)域具備運(yùn)用使用價(jià)值，如木耳飲品、木耳原漿、油類等。研究發(fā)現(xiàn)，木耳含糖量可以明顯增強(qiáng)人體免疫能力，抑止小白鼠脾網(wǎng)織紅細(xì)胞轉(zhuǎn)換繁衍工作能力，提高其巨噬細(xì)胞吞食工作能力和當(dāng)然殺傷力體細(xì)胞活力。腸道微生物是身體的關(guān)鍵新陳代謝“人體器官”，在消化、基礎(chǔ)代謝和免疫反應(yīng)等生命活動(dòng)中充分發(fā)揮關(guān)鍵功效。伴隨著對(duì)腸道微生物與人體健康研究的深層次，發(fā)覺(jué)一切正常生理學(xué)情況下身體腸菌處在平衡情況，當(dāng)內(nèi)環(huán)境破壞或遭受外部影響時(shí)，會(huì)造成 腸胃內(nèi)有益菌混亂，對(duì)人體身心健康造成危害。比如，抗生素濫用會(huì)毀壞腸道微生物物種均衡，提升炎性病癥風(fēng)險(xiǎn)性。益生菌粉根據(jù)代謝一系列抑菌化學(xué)物質(zhì)（有機(jī)物、雙氧水和病菌素等）減少腸內(nèi)pH，提升短鏈脂肪酸（Shortchainfattyacid，SCFA）成分來(lái)降低病原菌活菌數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，含糖量能夠增進(jìn)腸胃優(yōu)點(diǎn)菌繁衍和調(diào)整腸胃內(nèi)分必物，進(jìn)而促使腸胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和身體身心健康。

雖然木耳具備較高的食用價(jià)值和寬廣的應(yīng)用前景，可是其含糖量成份對(duì)腸道微生物的控制功效與體制仍不清楚。為了更好地明確木耳含糖量對(duì)腸菌轉(zhuǎn)變 的調(diào)節(jié)效用以及微生物作用，本科學(xué)研究運(yùn)用小白鼠實(shí)體模型，剖析木耳胞外含糖量對(duì)小白鼠腸菌多元性、SCFA成分轉(zhuǎn)變 及血清蛋白細(xì)胞因子的危害，為木耳含糖量益生菌粉微生態(tài)制劑和新式營(yíng)養(yǎng)食品的研發(fā)給予理論基礎(chǔ)。

1原材料與方式

1.1原材料與實(shí)驗(yàn)試劑

木耳菌種（GenBank：KF297975.1，天津市科技學(xué)院生物技術(shù)與生物學(xué)試驗(yàn)室儲(chǔ)存）。工業(yè)乙醇（剖析級(jí)）、葡萄糖水（剖析級(jí)）、硫酸（剖析級(jí)）、二甲苯（剖析級(jí)），天津市北方地區(qū)天醫(yī)化學(xué)藥品廠；三氯甲烷（剖析級(jí)）、異戊醇（剖析級(jí)）、二氯甲烷（色譜儀級(jí)），上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲酸、己酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸，上海源葉生物技術(shù)有限責(zé)任公司；三聚磷酸鈉抗原修復(fù)液，上海市碧云天生物技術(shù)性有限責(zé)任公司；牛血清蛋白，北京索萊寶高新科技有限責(zé)任公司；GPR43抗原，圣克魯斯生物科技（上海市）有限責(zé)任公司；FIＴC標(biāo)識(shí)的瑩光二抗，賽默飛世爾高新科技（我國(guó)）有限責(zé)任公司；酶聯(lián)免疫吸咐（ELISA）檢測(cè)試劑盒，上海市茁彩生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

SPF級(jí)近交系CD-1雌鼠18只，休重（20±3）g，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證編號(hào)：SCXK（京）2016-0006，購(gòu)于北京市維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)性有限責(zé)任公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

AB204-S型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器設(shè)備深圳公司；GH-6000型電加熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；ALPHA2-4/LD型冷凍式干燥機(jī)，法國(guó)CHRIS企業(yè)；722型紫外線光度計(jì)，上海精科分析儀器公司；7890A氣相色譜，英國(guó)安捷倫科技有限責(zé)任公司；BX53正置光學(xué)顯微鏡，日本Olympus企業(yè)。

1.4木耳胞外含糖量獲取

木耳發(fā)醇塑造參考肖紅霞的方式 。發(fā)酵物經(jīng)3000r/min離心式20min棄沉積，上清液立即開展真空蒸發(fā)，濃縮至原容積的1/4，添加工業(yè)乙醇（容積分?jǐn)?shù)30%），4℃留宿。3000r/min離心式20min后，往上清水溶液添加去蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)試劑（三氯甲烷異戊醇=1∶4）并磁力攪拌10min，3500r/min離心式15min棄沉積，上清液添加工業(yè)乙醇（摩爾分?jǐn)?shù)75%）4℃留宿。4000r/min離心式15min獲得沉淀即是粗多糖，將含糖量沉積自來(lái)水復(fù)溶后分析12h，每2h換1次水，接著低溫干燥，獲得木耳胞外含糖量。

1.5含糖量的評(píng)定及單糖構(gòu)成剖析

1.5.1含糖量的紅外光譜分析分析

稱量木耳胞外含糖量1mg，添加適量溴化鉀（KBr）粉末狀于研缽中，充足碾磨后碾成全透明片狀，接著用NicoletIS10FＴIR光譜分析儀（ＴhermoScientific，英國(guó)）在400～4000cm-1峰位范疇內(nèi)掃描儀，紀(jì)錄IR光譜儀。

1.5.2含糖量的單糖構(gòu)成剖析

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高效率液相色譜，融合PMP（1-苯基-3-羥基-5吡唑啉酮）柱前衍化畫法對(duì)木耳胞外含糖量試品做好了單糖構(gòu)成剖析。含糖量的溶解和衍化化方式參考王媛媛等科學(xué)研究。高效液相色譜檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以下：C18離子交換柱；流動(dòng)性相為0.1mol/LpH6.5硫酸銨緩存鹽∶乙腈（V/V）=85∶15；流動(dòng)速度1mL/min；柱溫40℃；檢驗(yàn)光波長(zhǎng)250nm；進(jìn)樣量20μL。

1.6小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.6.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)排序及解決

將購(gòu)入的18只身心健康CD-1雌蟲小白鼠喂養(yǎng)在20～22℃、45%～55%RH的無(wú)菌檢測(cè)清潔自然環(huán)境中，讓其隨意進(jìn)餐（市面上一般精飼料），適應(yīng)能力飼養(yǎng)7d。將其任意分成2組（每一組9只）即實(shí)驗(yàn)對(duì)照實(shí)驗(yàn)（Control），木耳胞外含糖量組（Fermentation-exopolysaccharide，F(xiàn)-P）。將木耳胞外含糖量用鹽水配備，隨后依照1.5g·kg^-1BW^-1開展灌胃解決（每只小白鼠每一次給藥容積為0.2mL），持續(xù)灌胃21d；對(duì)照實(shí)驗(yàn)給與等大小的鹽水解決。

1.6.2小白鼠休重及內(nèi)臟器官指數(shù)

實(shí)驗(yàn)期內(nèi)每7d紀(jì)錄1次小白鼠休重，將2組休重均值做變化趨勢(shì)。第21天，脫位法處決小白鼠后，迅速分離出來(lái)肝、脾、心、肺、腎等內(nèi)臟器官，內(nèi)臟器官用吸水海綿吸走后，開展稱重和數(shù)據(jù)收集，最終對(duì)內(nèi)臟器官指數(shù)及穩(wěn)定性開展評(píng)定。

內(nèi)臟器官指數(shù)=（內(nèi)臟器官品質(zhì)/休重）×100%。

1.6.3小白鼠腸菌剖析評(píng)定

灌胃實(shí)驗(yàn)完成后（第21天），無(wú)菌檢測(cè)收集新鮮排泄物0.1g，放進(jìn)殺菌管，將被測(cè)試品交派森諾生物技術(shù)有限責(zé)任公司開展有益菌評(píng)定剖析。步驟以下：最先獲取試品病菌總DNA，隨后以微生物菌種核糖體RNA總體目標(biāo)編碼序列為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)方案16SrRNAＶ3-Ｖ4區(qū)的非特異引物設(shè)計(jì)，等溫?cái)U(kuò)增搭建百度文庫(kù)。搭建好的百度文庫(kù)經(jīng)梯度方向稀釋液，運(yùn)用IlluminaMiSeq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)平臺(tái)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果根據(jù)生物信息學(xué)方式開展亞基因剖析和腸道微生物兩棲綱剖析。

1.6.4小白鼠排泄物中SCFAs成分剖析

低溫干燥排泄物試品，精確稱量50mg試品，添加1.2mL聚磷酸鹽緩沖溶液（pH7.3）攪拌，4℃14000r/min離心式20min，汲取上清液至5mL離心管架中。每200μL上清添加0.1mL的稀釋液后鹽酸（摩爾分?jǐn)?shù)50%），充足攪拌3min，用2mL二氯甲烷（色譜儀級(jí)）開展提純，4℃靜放2h，隨后用0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)慮。選用氣象色譜儀（GC）檢驗(yàn)試樣中短鏈脂肪酸的成分，試品獲取方式參考Zhao等并做一部分改動(dòng)。GC剖析選用基本HP-FFAP（25m×0.32mm，0.5μm）配備柱，程序流程設(shè)置參考賈益群等在微生物試品油酸獲取與解析的分析結(jié)果，并更改其分離之比20∶1。SCFA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水溶液的配制及其標(biāo)曲制作參考孟拓等對(duì)氣象色譜儀-質(zhì)譜分析聯(lián)用分析法腸道炎小白鼠短鏈脂肪酸新陳代謝科學(xué)研究結(jié)果。

1.6.5小白鼠乙狀結(jié)腸GPR43檢驗(yàn)

小白鼠灌胃21d后，脫位法處決小白鼠迅速分離出來(lái)腸胃交武漢市谷歌生物高新科技有限責(zé)任公司制做石蠟切片。取乙狀結(jié)腸石蠟切片用二甲苯脫臘解決，經(jīng)不一樣濃度梯度酒精開展凝固解決后用三聚磷酸鈉抗原修復(fù)液95℃溫育15min開展抗原修復(fù)，并將其降溫到室內(nèi)溫度，經(jīng)3%BSA室內(nèi)溫度封閉式解決30min完用GPR43抗原4℃孵育12h，以后用FIＴC標(biāo)識(shí)的瑩光二抗室內(nèi)溫度遮光孵育1.5h，再用DAPI室內(nèi)溫度遮光孵育30min，執(zhí)行封片并留宿吹干，于暗室標(biāo)準(zhǔn)下開展光學(xué)顯微鏡觀查。

1.6.6小白鼠血清蛋白細(xì)胞因子測(cè)量

小白鼠灌胃21d后，根據(jù)摘目光采血，并將血夜儲(chǔ)存在帶有乙二胺四乙酸絡(luò)合劑（EDＴA）的搜集管內(nèi)，4℃儲(chǔ)放3h。待當(dāng)然沉淀后，用無(wú)菌檢測(cè)槍嘴汲取血清蛋白，運(yùn)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)量小白鼠血清蛋白中IL-6、IL-10和ＴNF-α的成分。實(shí)驗(yàn)流程參考上海市茁彩生物技術(shù)有限責(zé)任公司ELISA檢測(cè)試劑盒實(shí)際操作使用說(shuō)明。

1.7應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)剖析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用Graphpad5.0分析系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析，t檢驗(yàn)剖析每組間顯著性差異，數(shù)據(jù)信息以x-±s表明，當(dāng)P＜0.05時(shí)，覺(jué)得具備顯著性差異。