食用植物酵素(edible plant Jiaosu)是指 以可用于食品加工的植物為主要原料，添加 或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定 生物活性成分可供人來食用的酵素產(chǎn)品. 其在含有植物本身的多種維生素、酶和礦物 質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，還通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生 新的次生代謝物及活性成分，與直接食用蔬菜 水果相比，酵素中的生物活性成分和有機(jī)小分 子更為濃縮，而且更容易為人體所吸收。 食用植物酵素作為一種功能性微生物發(fā)酵制 品因其豐富的營(yíng)養(yǎng)和顯著的功效多年來盛行 于歐美、東南亞、日本以及臺(tái)灣地區(qū)，受到 國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注4。目前有關(guān)自然發(fā) 酵蘋果酵素的研究多以短期發(fā)酵為主，楊小 幸等在發(fā)酵第21天時(shí)獲得了較高總酚含 量與DPPH自由基清除率的蘋果酵素，李飛 等研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵50d的蘋果醛素的抗氧 化活性基本呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。但以上研究由于 發(fā)酵周期較短，產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定，酒精含量 容易超標(biāo)，而且研究表明，酵素是時(shí)間的產(chǎn) 物，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)品中的活性物 質(zhì)逐漸增加7"1，因此進(jìn)一步闡明蘋果酵素 自然發(fā)酵過程中理化指標(biāo)和抗氧化活性的動(dòng) 態(tài)變化很有必要的。筆者以富士蘋果為原料， 研究了蘋果酵素自然發(fā)酵過程中理化指標(biāo)和 抗氧化活性的變化，以期為進(jìn)一步闡明蘋果 酵素保健功能機(jī)理和綜合性開發(fā)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

指示富士蘋果品種為長(zhǎng)富2號(hào)，采自甘 肅省慶陽市有機(jī)蘋果基地之一的慶陽市西峰 區(qū)什社鄉(xiāng)。供試冰糖為市售，供試純凈水為 自制。供試氫氧化鈉、酚酞、DPPH、乙醇、 ABTS、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯化鐵、 硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、Tris、鄰苯三 酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均由中瑞化 學(xué)試劑公司提供，均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Uv-1100型紫外可見分光光度計(jì)〔上海 凌析達(dá)儀器有限公司)、LRH-70型恒溫培養(yǎng) 箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、YXQLS75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有 限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、DK-S24數(shù)顯恒溫水浴 鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、MIRCOCL17R離心機(jī)[賽默飛世爾科技(中國)有限公 司]、超低溫冰箱(青島海爾集團(tuán))、DL-CJ1N超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限 公司)、PB-10型精密pH計(jì)[賽多利斯科學(xué) 儀器(北京)有限公司]。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1蘋果酵素生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程旳蘋 果原料選擇→清洗→去核→切分→裝罐→加 水、加糖→發(fā)酵→過濾→成品。

1.3.2操作要點(diǎn)新鮮蘋果用純凈水沖洗干 凈，瀝干水分后去核并切分成3~5 mm的 片，冰糖破碎后用紫外燈輻照處理30 min。 將蘋果片與純凈水按質(zhì)量比200 : 1 000 加 入無菌酵素發(fā)酵罐中，加人15%的冰糖調(diào)節(jié) 糖度，置陰涼干燥的發(fā)酵車間，常溫(20～26℃)下自然發(fā)酵30 d后濾去果肉(防止產(chǎn) 生過多不利于健康的氨氮等)，繼續(xù)發(fā)酵至90d。發(fā)酵第Ⅰ個(gè)月隔天攪拌通氣，第2個(gè) 月有氧發(fā)酵，之后密封發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束取上 清液進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。每組試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.3理化指標(biāo)變化︰總酸含量參照GB T124562008的方法測(cè)定， pH采用pH 計(jì)法測(cè)定，可溶性固形物含量采用糖度計(jì)法 測(cè)定-u1，乙醇含量采用密度瓶法測(cè)定.

1.3.4抗氧化活性測(cè)定DPPH自由基清除 能力、超氧自由基清除能力、羥基自由基清 除能力、ABTS自由基清除能力測(cè)定均參考 樊秋元[ ]的方法。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010、sPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析處理及作圖。

2結(jié)果與分析

2.1蘋果酵素自然發(fā)酵過程中的理化指標(biāo) 變化

可溶性固形物、pH、總酸、乙醇等是 衡量蘋果酵素發(fā)酵成熟的主要理化指標(biāo)，也 是影響酵素品質(zhì)的重要因素。由圖1 可以看出，可溶性固形物含量隨著發(fā)酵時(shí)間 的延長(zhǎng)呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)，發(fā)酵30 d 內(nèi)營(yíng)養(yǎng)充分，微生物快速繁殖，迅速消耗碳 水化合物，使酵素液中可溶性固形物含量迅 速從15.0°Brix降至7.2°Brix;隨后緩慢降 低，發(fā)酵90d時(shí)可溶性固形物含量降為4.5 Brix，比發(fā)酵初期降低了70%。pH隨著發(fā) 酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，發(fā)酵前30 d迅 速從4.50降低至3.22，說明微生物在發(fā)酵 前期為大量繁殖階段，隨后由于有機(jī)酸的積 累pH平穩(wěn)下降至發(fā)酵結(jié)束時(shí)的3.06，與發(fā) 酵初期相比，pH下降了32%，同時(shí)因?yàn)槲?生物的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的二氧化碳在水中形成 氣泡，可能由于氣泡的不穩(wěn)定性，致使pH 在下降的同時(shí)也出現(xiàn)回升的情況。總酸 在發(fā)酵前30 d 逐漸升高，從最初的0.9 gL 升高至3.2 gL，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵前期為通 氣發(fā)酵階段，微生物代謝產(chǎn)生的二氧化碳和 有機(jī)酸使得總酸含量逐漸升高;發(fā)酵30～60 d 總酸含量快速升高至36.7 gL，此階段 為有氧發(fā)酵階段，發(fā)酵液中的乙醇、己糖等 代謝產(chǎn)物通過微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙酸和乳酸 等有機(jī)酸，既提高了蘋果酵素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 又形成其獨(dú)特的風(fēng)味;隨后由于發(fā)酵緩慢，總酸含量略有升高，至發(fā)酵結(jié)束總酸含 量達(dá)到42.9g/L，與發(fā)酵初期相比總酸含量 增加了98%。乙醇含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng) 呈先升高后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵30d內(nèi)碳水 化合物含量高，微生物發(fā)酵產(chǎn)生大量的乙 醇，導(dǎo)致乙醇含量從0迅速增加至79.0 g/L, 隨后通過有氧發(fā)酵促使乙醇生成乙酸，乙 醇含量迅速降低至13.0 g/L, 60 d后緩慢降 低，在發(fā)酵90 d時(shí)乙醇含量為10gL,符合 QB/T5323- 2018 有關(guān)規(guī)定。

2.2蘋果酵素自然發(fā)酵過程中抗氧化能力 的變化

通過比較分析DPPH自由基清除率、超. 氧陰離子自由基清除率、羥基自由基清除 率、ABTS自由基清除率等4種抗氧化活性 體系，對(duì)蘋果酵素自然發(fā)酵過程中抗氧化能 力進(jìn)行評(píng)價(jià)。由圖2可以看出，DPPH自由. 基清除率、超氧陰離子自由基清除率、羥基 自由基清除率、ABIS自由基清除率在蘋果 酵索發(fā)酵過程中抗氧化能力變化規(guī)律大體較 為一致，DPPH自由基清除率和羥基自由基 清除率發(fā)酵前60d逐漸上升，60d后趨于 穩(wěn)定上升;發(fā)酵90d時(shí)自由基清除率分別 從發(fā)酵初期的47.82%和43.05%上升至86.16%和79.03%，升高了44.50%和45.53%。 超氧陰離子自由基清除率和ABIS自由基清 除率發(fā)酵前75 d逐漸上升并達(dá)到峰值，分 別為65.06%和69.04%，與發(fā)酵初期相比分 別升高了39.12%和46.47%，隨后略有降低。 說明發(fā)酵75~90d時(shí)的蘋果酵素抗氧化活 性較好，這可能與該階段通過微生物代謝酵素中積累了較多的抗氧化物質(zhì)、功效酶以及 微生物的多樣性有關(guān)。

3結(jié)論與討論

研究表明，蘋果酵素自然發(fā)酵過程中，30 d內(nèi)酵素液中碳水化合物充足，微生物迅 速生長(zhǎng)繁殖，可溶性固形物含量和pH迅速 降低﹔隨后進(jìn)人平穩(wěn)變化階段，總酸含量逐 漸升高，乙醇含量先升高后降低，發(fā)酵至60 d時(shí)才逐漸進(jìn)入平穩(wěn)變化階段。在發(fā)酵90 d時(shí)，可溶性固形物含量降為4.5Brix, 與發(fā)酵初期相比降低了70%，pH下降至3.06，降低了32%;總酸含量增加至42.9 gL，增加了98%，乙醇含量為1.0 gL，符 合QB/T5323—2018規(guī)定。蘋果酵素發(fā)酵75~90 d時(shí)抗氧化活性較好，DPPH自由基 和羥基自由基在發(fā)酵0 d時(shí)清除率分別為86.16%和79.03%，分別升高了44.5%.45.53%;超氧陰離子自由基清除率和ABTS 自由基的清除率呈現(xiàn)發(fā)酵前75 d逐漸上升 達(dá)到峰值，分別為65.06%和69.04%，分別 升高了39.12%和46.47%，這可能是由于通 過微生物代謝酵素中積累了較多的抗氧化物 質(zhì)和功效酶，并且微生物多樣性較好。 有關(guān)抗氧化物質(zhì)如總酚、總黃酮，功效酶如 超氧化物歧化酶(SOD)活性等以及微生物多 樣性與抗氧化活性之間的關(guān)系有待于研究。