2 水環(huán)境中致病菌的檢測技術(shù)

近年來，水環(huán)境中致病菌的檢測取得了一定的研究進(jìn)展，已從單一基于培養(yǎng)法的傳統(tǒng)致病菌檢測方法發(fā)展至多種分子生物學(xué)檢測方法，這些技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展為致病菌檢測提供了新的思路。水環(huán)境中致病菌檢測技術(shù)的發(fā)展歷程見圖 1。

目前最普遍的致病菌檢測方法是培養(yǎng)法和聚合酶 鏈 式 反 應(yīng) ( Polymerase Chain Ｒeaction， PCＲ) 。這 2 種方法在選擇性和靈敏度方面都很突出，但培養(yǎng)法比 PCＲ 法更耗時(shí)。一些新興的方法如生物傳感器正在開發(fā)中，其未來的發(fā)展方向是滿足低成本、高選擇性要求。高通量測序由于通量高和無須特異性引物等優(yōu)點(diǎn)正逐漸取代傳統(tǒng)檢測方法，但也存在錯(cuò)誤率高等局限性。近年來致病菌檢測方法的檢測限及其應(yīng)用見表 2。目前，致病菌檢測方法還存在相似亞種難以區(qū)分、致病性及樣品濃縮帶來的抑制物等問題，這對新檢測方法的開發(fā)是重大挑戰(zhàn)。

2． 1 PCＲ 和實(shí)時(shí)定量 PCＲ PCＲ 是目前致病菌檢測中應(yīng)用最廣泛的分子

生物學(xué)方法之一，其通過擴(kuò)增特定的靶基因序列來完成致病菌檢測。主要通過變性、退火和延伸( 退火和延伸也可以同時(shí)進(jìn)行) 3 個(gè)步驟最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的指數(shù)放大。中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)( SN/T 1896—2007) 中采用 PCＲ 技術(shù)對食品中的多種致病菌( 沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌 O157: H7、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌) 進(jìn)行快速定性檢測。

實(shí) 時(shí) 定 量 PCＲ ( quantitative real-time PCＲ， qPCＲ) 是在 PCＲ 技術(shù)基礎(chǔ)上利用熒光信號值實(shí)時(shí)檢測目的基因，通過內(nèi)參或外參法對樣品中的特定基因進(jìn)行定量分析，比常規(guī) PCＲ 更為靈敏。已有大量研究采用 qPCＲ 方法定量致病菌，如大腸桿菌和沙門氏菌 等。分別采用qPCＲ 方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測河口水樣中大腸桿菌和腸 球 菌，發(fā) 現(xiàn) qPCＲ 方法的檢測限能達(dá)到1 CFU/100 mL，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。但是 qPCＲ也存在 DNA 回收效率低和對引物特異性要求高的問題。此外，qPCＲ 在檢測中還面臨其他一些挑戰(zhàn)，如反應(yīng)中存在 PCＲ 抑制物。即使少量的PCＲ 抑制物也會(huì)延遲復(fù)雜樣品的閾值循環(huán)( Cq ) ，從而導(dǎo)致模板拷貝數(shù)比實(shí)際值低。為防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，可在 PCＲ 反應(yīng)中加入對抑制物具有高靈敏度的內(nèi)部陽性對照( 如內(nèi)參基因) 進(jìn)行檢測。此外，提取過程中殘留的抑制物如胍鹽和苯酚可采用 QuickDrop 和 NanoDrop 分光光度計(jì)檢測，也可以通過凝膠電泳確定是否有 ＲNA、DNA 及蛋白污染。如果樣品中含有蛋白等其他雜質(zhì)的污染，可以使用磁珠進(jìn)行核酸純化。與此同時(shí)，qPCＲ 無法識別活菌或死菌，會(huì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果。目前，一般 采 用 疊 氮 溴 化 丙 錠 ( propidium monoazide， PMA) 對樣品進(jìn)行前理，從而避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。PMA 是一種高度光敏的 DNA 結(jié)合染料，不能透過完整的活細(xì)胞膜，卻能選擇性地透過不完整的死細(xì)胞膜。PMA 能與 DNA 結(jié)合形成不可逆共價(jià)鍵，抑制死細(xì)胞 DNA 的擴(kuò)增以達(dá)到區(qū)分死、活細(xì)胞的目的。

此外，PCＲ 與 qPCＲ 對于致病菌的批量檢測存在一定的局限性。針對上述問題，多重 PCＲ、微滴 式 數(shù) 字 PCＲ 等技術(shù)相繼產(chǎn)生。多 重 PCＲ ( multiplex PCＲ，mPCＲ) ，又稱多重引物 PCＲ 或復(fù)合 PCＲ，是在同一 PCＲ 反應(yīng)管中同時(shí)加上多種特異性引 物 進(jìn) 行 PCＲ 擴(kuò) 增。微 滴 式 數(shù) 字 PCＲ ( Droplet Digital PCＲ，ddPCＲ) 是第三代 PCＲ 技術(shù)，屬于單分子分析，可用于絕對定量。用 ddPCＲ 和 qPCＲ 計(jì)數(shù)河流環(huán)境中的沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)水中 ddPCＲ 的靈敏度和線性范圍與 qPCＲ 相當(dāng)，但沉積物樣品中 ddPCＲ 的靈敏度和線性范圍明顯更高。多重 PCＲ 和微滴式數(shù)字 PCＲ 技術(shù)都克服了傳統(tǒng) PCＲ 方法高成本、通量有限、流程復(fù)雜、精確度低等缺點(diǎn)。但是 mPCＲ 存在多目標(biāo)擴(kuò)增條件不相容的問題，ddPCＲ 檢測高濃度樣品時(shí)的線性度明顯下降。

2． 2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

近年來新發(fā)展起來的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，無論是實(shí)際操作還是儀器要求方面都比 PCＲ 技術(shù)更為簡單方便，在臨床和現(xiàn)場監(jiān)測中具有良好的前景，其中，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增( LAMP) 已經(jīng)得到一定的應(yīng)用。該技術(shù)是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，其主要原理是使用 4 條特異性引物分別識別靶基因的 6 個(gè)特定區(qū)域，通過鏈置換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)等溫條件下基因的快速擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高( 檢測限比傳統(tǒng)的 PCＲ 方法低 2 ～ 5 個(gè)數(shù)量級) 、反應(yīng)時(shí)間短( 30 ～ 60 min) 、臨床使用不需要特殊儀器和操作簡單( 反應(yīng)液、酶和模板的混合液置于 63 ℃ 左右水浴鍋或恒溫箱中 30 ～ 60 min) 。使用改性的 LAMP 定量分析地表中的大腸桿菌和傷寒沙門氏菌，靈敏度動(dòng)態(tài)范圍為 0． 3 ～ 10 000 cells/mL，高濃度抑制物對定量結(jié)果影響較小，且 1 h 內(nèi)能夠完成檢測。LAMP 技術(shù)基于 4 ～ 6 個(gè)引物的結(jié)合，所以比 qPCＲ 擴(kuò)增效率低，也常常因非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)假陽性結(jié)果。目前常用的防止假陽性結(jié)果出現(xiàn)的方法主要包括:

( 1) 使用特定結(jié)構(gòu)的PCＲ 管，該管中有一個(gè)固定的小隔板將管分成 2 個(gè)區(qū)域，分別加入反應(yīng)液和 DNA 染料，但這種方法增加了加液次數(shù)，不適用于大批量檢測;

( 2) 將染料包埋在石蠟中，反應(yīng)結(jié)束后高溫熔化石蠟進(jìn)而釋放染料，但該方法增加了前處理時(shí)間。