紅花，為一年生草本植物菊科紅花屬綠色植物，主莖呈冠狀動(dòng)脈，葉柄健壯，花絲多呈紅、桔紅、桔黃色、黃、淡黃、白等色。種籽為瘦果，種沁色分白、灰、黑、褐黑色，開花期為一年的6～7月份，結(jié)果期為8～9月份。紅花籽粕是紅花籽提油后的副產(chǎn)物，壓榨油后的紅花籽粕有二種：即帶殼籽粕和去殼籽粕，在其中帶殼的蛋白質(zhì)含量為19%，而去殼的蛋白質(zhì)含量達(dá)到40%。即便帶殼籽粕的營(yíng)養(yǎng)成分還可以與紫花苜蓿相提并論，在養(yǎng)殖業(yè)中作為精飼料加上，能為肥育家畜的精飼料；而去殼籽粕則更與亞麻子油餅類似，在老母雞精飼料中可同時(shí)替代蛋白加上。有新聞報(bào)道稱，根據(jù)對(duì)一部分市面上紅花籽粕的科學(xué)研究，營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)值測(cè)量如下所示：在其中粗脂肪20%、膳食纖維31%、粗蛋白吸收率78%、膳食纖維吸收率14.3%，因?yàn)槠湮章瘦^高，尤其適用做為乳牛精飼料，對(duì)產(chǎn)奶量及質(zhì)量都會(huì)有非常大程度上的提升 ，是一種十分具備研發(fā)使用價(jià)值的副產(chǎn)物；紅花籽粕所含蛋白質(zhì)碳水化合物歸屬于徹底碳水化合物，帶有身體需要的18種碳水化合物，在其中8種必須氨基酸成分較高，約占碳水化合物總產(chǎn)量的30%上下；除此之外，紅花籽粕在農(nóng)牧業(yè)中可以用做抗冷劑、抗蟲劑和有機(jī)肥等。

紅花籽粕帶有充足的蛋白質(zhì)，其配制成的抗氧化性肽具備極強(qiáng)的復(fù)原力，中國(guó)對(duì)紅花籽粕蛋白質(zhì)運(yùn)用科學(xué)研究的非常少，為提升紅花籽粕運(yùn)用市場(chǎng)前景，本分析選擇蛋白酶k，并添加超聲波輔助水解反應(yīng)，對(duì)紅花籽粕蛋白質(zhì)的提煉加工工藝完成提升，為紅花籽粕的開發(fā)利用及開發(fā)設(shè)計(jì)有關(guān)高效益的功能食品給予技術(shù)性根據(jù)。

一、試驗(yàn)原材料與方式

1、原材料與儀器設(shè)備

紅花籽粕：新疆省原產(chǎn)地；蛋白酶k、蛋白酶和枯草枯草芽孢菌中性蛋白酶：上海市比多實(shí)業(yè)公司有限責(zé)任公司；三氯化鐵、鐵氰化鉀、30%雙氧水、鹽酸、硼酸、硫酸、磷酸氫二鈉、工業(yè)乙醇、氫氧化鈉溶液、酚酞、三氯乙酸、室內(nèi)甲醛、堿性品紅、磷酸二氫鈉：購(gòu)于鄭州市萊博實(shí)驗(yàn)儀器有限責(zé)任公司；實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。UNIVERSAL320快速冷凍離心機(jī)：Hettich有限責(zé)任公司；AUY120電子分析天平：SHIMADZUCORPOPATIONJAPAN；722E由此可見光度計(jì)：上海市光譜儀器有限責(zé)任公司；ALPHAL-2真空泵冷凍式干燥機(jī)：法國(guó)M.CHRIST企業(yè)；HH恒溫水浴鍋：江蘇金壇廣州中山大學(xué)儀器廠；PHS-25酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠：C21-IH02E9電磁灶：浙江省蘇泊爾股權(quán)有限責(zé)任公司；YP202N電子分析天平：上海精密儀表設(shè)備有限責(zé)任公司。

2、實(shí)驗(yàn)方法

（1）實(shí)驗(yàn)試劑的配置

pH7.0聚磷酸鹽緩沖溶液：量取61mL的0.02mol/L磷酸氫二鈉水溶液和39mL的0.02mol/L磷酸二氫鈉，混和勻稱，即是pH7.0聚磷酸鹽緩沖溶液。

0.02mol/L氫氧化鈉溶液標(biāo)液：稱量0.8g氫氧化鈉溶液溶解于水，滴定劑至100mL。0.05mol/L甘氨酸標(biāo)液：精確稱量375mg甘氨酸，融解后滴定劑至10mL。400mL中性化甲醛溶液：在50mL36%～37%分析純甲醛溶液中添加1mL0.5%酚酞酒精溶液，用0.02mol/L的氫氧化鈉溶液水溶液滴定管到微紅，貯于密閉式的瓶子中。

（2）紅花籽粕酶解液的制取

提油后的紅花籽粕用高速粉碎機(jī)開展破碎，過50目篩，取2.5g紅花籽粕于小燒瓶中，添加50mLpH7.0的硫酸銨緩沖液，于恒溫水浴鍋55℃水解反應(yīng)1h，滅酶活（100℃，10min）在10000r/min轉(zhuǎn)速比下冷藏離心式15min，取上清液，預(yù)留。

（3）酶魅力的測(cè)量

①超音波前后左右酶魅力的測(cè)量

提前準(zhǔn)備6支整潔的試管嬰兒，各自取酶液1mL于試管嬰兒中，番木瓜酶液、中性化酶液、蛋白酶液各兩只試管嬰兒，在其中三支作空白試驗(yàn)，此外三支先后添加3mLpH7.0磷酸緩沖液，37℃恒溫水浴鍋中加熱10min，添加pH7.0磷酸緩沖液配置的1%opo結(jié)構(gòu)脂水溶液1mL，混勻，37℃水浴10min或55℃標(biāo)準(zhǔn)下要超音波解決10min，，取下添加10mLTCA（三氯乙酸）水溶液中止反映，強(qiáng)烈搖晃，37℃水浴三十分鐘，冷藏離心式取上清液作7倍稀釋液，275nm處測(cè)OD值值A(chǔ)?？瞻自囼?yàn)：在添加底物以前添加TCA水溶液。

②胰蛋白酶酶魅力測(cè)算

提前準(zhǔn)備6支整潔的試管嬰兒，各自取酶液1mL于試管嬰兒中，番木瓜酶液、中性化酶液、蛋白酶液各兩只試管嬰兒，在其中三支作空白試驗(yàn)，此外三支先后添加3mLpH7.0磷酸緩沖液，37℃恒溫水浴鍋中加熱10min，添加pH7.0磷酸緩沖液配置的1%opo結(jié)構(gòu)脂水溶液1mL，混勻，37℃水浴10min或55℃標(biāo)準(zhǔn)下要超音波解決10min，，取下添加10mLTCA（三氯乙酸）水溶液中止反映，強(qiáng)烈搖晃，37℃水浴三十分鐘，冷藏離心式取上清液作7倍稀釋液，275nm處測(cè)OD值值A(chǔ)?？瞻自囼?yàn)：在添加底物以前添加TCA水溶液。每分水解反應(yīng)造成1µg色氨酸需要的酶量，即是一個(gè)酶活企業(yè)（U）。由色氨酸規(guī)范曲線方程（A=aC b）及酶活界定推得：

酶活=（A-b）×N/（a·水解反應(yīng)時(shí)間）（1）

式中N為稀釋倍數(shù)8；

A為吸光度值；

酶活企業(yè)為U/mL。

（4）L-色氨酸標(biāo)曲的創(chuàng)建

精確稱量于105℃干躁至恒重的L-色氨酸0.1g，用20mL1mol/L硫酸融解后，再用純凈水滴定劑至100mL，即是1mg/mL色氨酸標(biāo)液。汲取1mg/mL色氨酸標(biāo)液10mL，用0.1mol/L硫酸滴定劑至100mL，即獲得100µg/mL的L-色氨酸規(guī)范液。各自汲取100µg/mL的L-色氨酸規(guī)范液0、1、2、3、4、5、6mL于10mL容量瓶中，用純凈水滴定劑至標(biāo)尺，混勻，做成1ml各自含L-色氨酸0、10、20、30、40、50、60µg的規(guī)范應(yīng)用液，在275nm下測(cè)量各濃度值色氨酸水溶液的吸光度值，以色氨酸濃度值為橫坐標(biāo)軸，以該濃度值下水溶液所相匹配OD值為縱軸作標(biāo)曲，測(cè)算線性回歸方程和R2值。

（5）水解度的明確。

水解度DH=分散氮/高錳酸鹽指數(shù)

①測(cè)高錳酸鹽指數(shù)量（凱氏定氮法）

參照GB5009.5開展高錳酸鹽指數(shù)的測(cè)量，在開展試品檢測(cè)的一起做實(shí)驗(yàn)試劑空缺，測(cè)算高錳酸鹽指數(shù)成分。

②室內(nèi)甲醛滴定法測(cè)量分散氮

移取2mL旋蒸的溶解液，各自放置250mL的錐形瓶中，放水25mL；在其中一份加3滴中性化紅顯色劑，用校準(zhǔn)的NaOH水溶液滴定管至棕色為終點(diǎn)站。另一份添加中性化室內(nèi)甲醛10mL及3滴百里酚酞顯色劑，混勻，靜放1min，（這時(shí)深藍(lán)色消退）。再用以上校準(zhǔn)過的NaOH水溶液滴定管至淺藍(lán)色。紀(jì)錄2次滴定管所耗費(fèi)的NaOH的mL數(shù)，測(cè)算分散氮的成分。

（6）復(fù)原力的測(cè)量

配置一系列濃度值為5%的紅花籽粕底物水溶液（取2.5g籽粕，加緩沖溶液50mL），各自添加中性蛋白酶、蛋白酶k、蛋白酶，先調(diào)整pH，開展超音波解決10min，水解反應(yīng)1h，反映完畢之后歷經(jīng)100℃滅酶解決10min，在10000r/min轉(zhuǎn)速比下開展冷藏離心式，時(shí)間為15min，上清液歷經(jīng)低溫干燥儲(chǔ)備用。采用上清液來測(cè)量酶解液的復(fù)原工作能力。

取上清液預(yù)留，將酶解液稀釋液1倍，取1.0mL紅花籽粕酶解液于10mL的試管嬰兒中，先后添加0.2mol/LpH6.6的聚磷酸鹽緩沖溶液2.5mL、質(zhì)量濃度為1%的鐵氰化鉀水溶液2.5mL而且充足攪拌勻稱，于50℃標(biāo)準(zhǔn)下水浴維持20min，并快速制冷，隨后添加質(zhì)量濃度為10%三氯乙酸水溶液2.5mL，而且充足攪拌勻稱，在3000r/min轉(zhuǎn)速比冷藏離心式10min。汲取離心式后的上清液2.5mL，添加純凈水2.5mL和質(zhì)量濃度為0.1%三氯化鐵溶液0.5mL，靜放10min，在700nm光波長(zhǎng)下測(cè)量水溶液吸光度值，全部測(cè)量值均為三次數(shù)據(jù)信息均值。以700nm光波長(zhǎng)處的吸光度值尺寸來體現(xiàn)酶解液的復(fù)原力的大小，吸光度值越大，說明酶解液的抗氧化越強(qiáng)。