為了篩選產(chǎn)生吡咯喹啉醌，英文名為pyrroloquinoline quinone（PQQ）的菌株并提高PQQ發(fā)酵產(chǎn)量，該研究建立了一種快速的高效液相色譜法檢測(cè)PQQ，并采用了以甲醇為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，利用光譜法對(duì)樣品進(jìn)行初篩，高效液相色譜法（HPLC）對(duì)初篩得到的結(jié)果再進(jìn)行復(fù)篩。該研究還對(duì)篩選得到的菌株發(fā)酵產(chǎn)PQQ的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。研究結(jié)果顯示：從樣品中篩選得56株P(guān)QQ產(chǎn)生菌，搖瓶產(chǎn)量最高的一株為20.6 mg /L，通過(guò)16s rDNA 測(cè)序分析，鑒定該菌株為Methylopila sp.屬。對(duì)培養(yǎng)基成分中的碳源甲醇進(jìn)行了優(yōu)化研究，當(dāng)甲醇體積濃度為2.5%時(shí)，PQQ產(chǎn)量最高，為26.3 mg /L，相比于初始甲醇1.0%提高了28%。該研究建立的高效液相色譜法為PQQ高產(chǎn)菌株的篩選提供一種快速檢測(cè)方法，篩選到的菌株具有較高的甲醇耐受力和PQQ生產(chǎn)潛力，為之后的PQQ發(fā)酵研究提供參考。

吡咯喹啉醌，英文名為pyrroloquinoline quinone（PQQ），作為許多細(xì)菌脫氫酶（甲醇脫氫酶，乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶等）的輔助因子于1964年首次被發(fā)現(xiàn)，它是繼吡啶核苷酸和核黃素之后的第三種氧化還原酶的輔酶。PQQ在生物界的分布極為廣泛，在動(dòng)植物和微生物細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)其存在，但僅有部分革蘭氏陰性細(xì)菌能合成PQQ。

在具有合成PQQ能力的細(xì)菌中，絕大部分只能合成痕量的PQQ以供給細(xì)胞生長(zhǎng)，只有少部分可以生產(chǎn)過(guò)量的PQQ，并將其排泄到培養(yǎng)基中，其中以甲基營(yíng)養(yǎng)菌的合成能力最強(qiáng)，如甲基菌屬（Methylobacill），甲基單胞菌屬（Methylomonas），嗜甲基菌屬（Methylophilus）和甲基桿菌屬（Methylobacterium）等。此外，在納豆，青椒和獼猴桃等植物體內(nèi)也含有微量的PQQ，并且牛奶和人類的母乳中也存在較高濃度的PQQ。近幾十年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)PQQ具有多種生理功能，它是許多細(xì)菌脫氫酶的輔助因子，參與細(xì)胞的電子呼吸鏈傳遞；PQQ可以提高微生物細(xì)胞的抗逆性，并提高宿主菌的抗氧化能力[18]；PQQ還是動(dòng)植物刺激或生長(zhǎng)因子；此外，PQQ與葡萄糖脫氫酶結(jié)合形成PQQ-GDH全酶，可用作檢測(cè)葡萄糖的生物傳感器，也可用作生物燃料電池。

由于目前PQQ化學(xué)合成步驟復(fù)雜，副產(chǎn)物多，而微生物發(fā)酵生產(chǎn)PQQ成本低，步驟少，產(chǎn)物分離更容易，因此微生物發(fā)酵法成為最有前景的工業(yè)化生產(chǎn)路線。雖然對(duì)PQQ的研究已有幾十年，但其生物合成的具體過(guò)程尚未完全闡明，從環(huán)境中篩選高產(chǎn)野生菌依然是必不可少的。1992年，URAKAMI等篩選到一株P(guān)QQ產(chǎn)生菌，經(jīng)鑒定為生絲微菌Hyphomicrobium sp.TK0441，優(yōu)化培養(yǎng)基后在30 L發(fā)酵罐上發(fā)酵14天后PQQ產(chǎn)量可達(dá)到1 g/L。司振軍等[22]從土壤中篩選到一株甲基營(yíng)養(yǎng)菌，經(jīng)鑒定為Methylobacillus sp.zju323,未經(jīng)優(yōu)化的PQQ搖瓶產(chǎn)量為23.2 mg/L，在已報(bào)道的研究中屬于高水平。本研究建立了一種高效液相色譜法用來(lái)快速檢測(cè)PQQ，并從土壤樣品中篩選得到一株P(guān)QQ高產(chǎn)菌，并對(duì)其進(jìn)行了菌種鑒定和培養(yǎng)基優(yōu)化，為后續(xù)進(jìn)行PQQ的進(jìn)一步生產(chǎn)研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

細(xì)菌樣品來(lái)自于無(wú)錫生產(chǎn)甲醇工廠附近的土壤和污水。PQQ標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自于Sigma公司，其他試劑均購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)。

1.2儀器與設(shè)備

G180T滅菌鍋，美國(guó)致微儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；Agilent-1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：甲醇30 mg /L，(NH4)2SO4 3 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L ，KH2PO4 1.4 g/L，微量元素液 1 mL/L。固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉。

種子培養(yǎng)基：甲醇10 mg /L，(NH4)2SO4 3 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO4 1.4 g/L，微量元素液 1 mL/L。微量元素液：CaCl2·2H2O 30 mg/L，MnCl4·4H2O 5 mg/L發(fā)酵培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1 mL維生素液，維生素液配方（mg/L）：核黃素200，對(duì)氨基苯甲酸200，鹽酸硫胺素400，煙酸400，鹽酸吡哆醇400，泛酸鈣400，葉酸2，生物素2，肌醇2000。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 PQQ產(chǎn)生菌初篩方法的確立

光譜法：對(duì)PQQ標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)其在249 nm和330 nm處有兩個(gè)吸收峰，將200 μ L PQQ標(biāo)準(zhǔn)品溶液或發(fā)酵離心上清液轉(zhuǎn)移至96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè) OD330與 OD249，并將空白培養(yǎng)基以同樣的條件處理和檢測(cè)，從而減去培養(yǎng)基吸光值的干擾。

1.4.2 HPLC法檢測(cè)PQQ

由于PQQ的結(jié)構(gòu)上連有3個(gè)—COOH，因此其易溶于水，極性較大，在普通的C18反相色譜柱上不保留。目前采用較多的是離子色譜對(duì)法來(lái)檢測(cè)PQQ，但是離子色譜對(duì)平衡時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜且對(duì)柱子也有局限性；還有采用加酸調(diào)節(jié)pH來(lái)使PQQ保留在色譜柱上，但這使得峰形拖尾嚴(yán)重并且重現(xiàn)性不好。為此本實(shí)驗(yàn)選擇親水色譜柱來(lái)解決PQQ難以在色譜柱上保留的問(wèn)題。以水為流動(dòng)相，通過(guò)COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色譜柱，測(cè)定PQQ在249 nm和330 nm的吸光值，根據(jù)出峰面積確定其濃度。利用安捷倫1260系列高效液相色譜儀測(cè)定PQQ含量，進(jìn)樣量20 μ L，溫度30 ℃，流動(dòng)相為0.05 mol/L乙酸：0.05 mol/L乙酸銨=30：70，流速1 mL/min，在波長(zhǎng)249 nm和330 nm下檢測(cè)PQQ標(biāo)準(zhǔn)品和樣品含量。

1.4.3菌株的篩選

將樣品制成適當(dāng)濃度梯度的稀釋液，涂布于甲醇篩選培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)3~5天，分別挑取不同形態(tài)的單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min 培養(yǎng)3~5天，將發(fā)酵液離心取上清液，用光譜法快速檢測(cè)PQQ含量，再用HPLC法對(duì)PQQ產(chǎn)量較高的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.4.4菌種的鑒定

將PQQ產(chǎn)量最高的菌株在固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃培養(yǎng)3~5天，利用普通光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。取單菌落接種到搖瓶培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)，當(dāng)菌體OD600為0.5~1時(shí)，取3 mL發(fā)酵液，10000 r/min離心1 min，棄去上清液，收集菌體，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）提取DNA，利用細(xì)菌通用引物 27F：5'-AGA GTT TGA TCM TGGCTC AG -3'；1492R：5' -GGT TAC CTT GTT ACGACT T-3'，通過(guò) PCR 反應(yīng)擴(kuò)增該菌株的16s rDNA序列，將產(chǎn)物委托上海生工測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行BLAST比對(duì)，用軟件MEGA進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.4.5甲醇含量對(duì)菌體生長(zhǎng)和PQQ產(chǎn)量的影響

對(duì)培養(yǎng)基中的唯一碳源甲醇進(jìn)行優(yōu)化，研究甲醇的不同添加體積濃度（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%）對(duì)菌體生長(zhǎng)和PQQ產(chǎn)量的影響。

2結(jié)果與分析

2.1光譜法檢測(cè)PQQ

研究建立了基于光譜法檢測(cè)PQQ的快速篩選方法，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)PQQ在249 nm和330 nm左右有兩個(gè)吸收峰。考慮到發(fā)酵液中含有蛋白，核酸等在249 nm左右有吸收值的物質(zhì)，而在330 nm處有吸收值的物質(zhì)較少，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇研究PQQ濃度和OD330的關(guān)系。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)不同濃度 PQQ標(biāo)準(zhǔn)品的OD330（檢測(cè)樣品時(shí)要減去空白發(fā)酵培養(yǎng)基的吸光值以除去干擾），發(fā)現(xiàn)在330 nm下PQQ濃度與OD330關(guān)系為y=0.0218x-0.0354 (R2=0.9957)。當(dāng)PQQ濃度在2.5~50 mg/L之間時(shí)，二者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，由于野生菌產(chǎn)PQQ量多在1~20 mg/L左右，因此使用本方法進(jìn)行高通量篩選的初篩具有良好的可行性。